COX-2，bcl-2和c-erbB-2在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平及其相關(guān)性研究

余念祖，徐姍，徐獎(jiǎng)，鄧圣澤，江澤圣，楊玄勇

COX-2，bcl-2和c-erbB-2在人腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平及其相關(guān)性研究

余念祖1，徐姍2，徐獎(jiǎng)1，鄧圣澤1，江澤圣1，楊玄勇1

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006）

目的 探討腦膠質(zhì)瘤腫瘤中bcl-2，環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2），原癌基因HER-2/neu（c-erbB-2）的表達(dá)及二者與腫瘤惡性程度的關(guān)系。方法 采用經(jīng)病理和免疫組織化學(xué)染色證實(shí)的程度的低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO 0～Ⅱ級(jí)）25例，高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ，Ⅳ級(jí)）25例，對(duì)照組選用腦外傷患者的非腫瘤腦組織，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組組織的bcl-2，COX-2，c-erbB-2的蛋白表達(dá)并采用半定量積分法進(jìn)行結(jié)構(gòu)判定。結(jié)果 外傷非腫瘤腦組織中無bcl-2，COX-2，c-erbB-2的蛋白表達(dá)，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的bcl-2 32%，COX-2 18%，c-erbB-2 4%。高級(jí)別膠質(zhì)瘤bcl-2 76%，COX-2 72%，c-erbB-2 16%，在對(duì)3組間行兩兩比較，bcl-2，COX-2表達(dá)蛋白表達(dá)陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），c-erbB-2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析顯示，COX-2與bcl-2之間存在正相關(guān)性（r=0.682，P＜0.001），COX-2與cerbB-2之間有正相關(guān)性（r=0.33，P=0.018＜0.05）。bcl-2與c-erbB-2之間有正相關(guān)性（r=0.308，P=0.03＜0.05）。結(jié)論 bcl-2，COX-2，c-erbB-2可能通過相關(guān)聯(lián)系，影響膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)甚至惡變。

腦膠質(zhì)瘤；環(huán)氧化酶-2；原癌類蛋白；bcl-2蛋白

腫瘤的發(fā)生是多種基因參與、各個(gè)因素影響和多個(gè)步驟演變的復(fù)雜過程，而人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[1]，因?yàn)槠浣?rùn)性生長(zhǎng)的特性，腫瘤界限不清，手術(shù)難以全部切除干凈；無控性增殖的特性，亦使治愈非常困難。近年研究表明，bcl-2，COX-2，c-erbB-2參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控[2-4]，因此，本文旨在研究COX-2，bcl-2及c-erbB-2在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平與其惡性程度的關(guān)系，探討三者在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2015年6月～2016年12月之間手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤標(biāo)本50例，其中男35例，女15例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療。標(biāo)本常規(guī)切片，HE染色，由病理科資深醫(yī)師閱片，將WHO 0～Ⅱ級(jí)的患者25例歸為低級(jí)別膠質(zhì)瘤組，WHOⅢ，Ⅳ級(jí)的患者25例歸為為高級(jí)別膠質(zhì)瘤組，為另取外傷手術(shù)中行內(nèi)減壓術(shù)切除的正常腦組織10例作為正常對(duì)照。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆bcl-2抗體，鼠抗人單克隆c-erbB-2抗體和兔抗人單克隆COX-2抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品SP免疫組化染色試劑盒及濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用SP法進(jìn)行COX-2、bcl-2及c-erbB-2染色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，采用高壓蒸汽法修復(fù)抗原。

1.4 結(jié)果判定 COX-2蛋白及Bcl-2蛋白的陽性染色均定位為細(xì)胞質(zhì)和或細(xì)胞膜，采用半定量積分法（包括染色強(qiáng)度與平均陽性細(xì)胞率）判斷結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料是采用方差分析，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

COX-2在正常非腫瘤腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、高級(jí)別膠質(zhì)瘤的陽性率分別為0%、28%、72%，陽性細(xì)胞率隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而增高，進(jìn)一步做兩兩比較發(fā)現(xiàn)COX-2低級(jí)別膠質(zhì)瘤組vs高級(jí)別膠質(zhì)瘤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.486，P=0.02＜0.05）；正常腦組織vs高級(jí)別，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.00，P＜0.01）；正常腦組織vs低級(jí)別組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.4，P=0.065＞0.05）。

bcl-2在正常非腫瘤腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、高級(jí)別膠質(zhì)瘤的陽性率分別為0%、32%、76%，表明膠質(zhì)瘤惡性程度越高，bcl-2陽性細(xì)胞率越高，兩兩比較提示各組別差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

c-erbB-2在正常非腫瘤腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、高級(jí)別膠質(zhì)瘤的陽性率分別為0%、4%、16%，c-erbB-2：高級(jí)別膠質(zhì)瘤組vs低級(jí)別膠質(zhì)瘤組（χ2=2，P=0.157＞0.05）；高級(jí)別組vs正常腦組織（χ2=1.755，P=0.185＞0.05）；c-erbB-2低級(jí)別膠質(zhì)瘤組vs正常腦組織（χ2=0.4，P=0.527＞0.05）。該蛋白在正常腦組織與高級(jí)別和低級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)Spersman等級(jí)相關(guān)分析提示，COX-2蛋白與bcl-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.682，P＜0.001）COX-2蛋白與cerbB-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析COX-2蛋白與c-erbB-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.33，P=0.018＜0.05）bcl-2蛋白與cerbB-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.308，P=0.03＜0.05），見圖1、圖2。

3 討論

圖1 COX-2，蛋白在低級(jí)別及高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（EliVisionTM免疫組織化學(xué)染色）（×400倍）Figure 1 The expression of COX-2 protein in glioma after immunohistochemical staining(figure a is low-degreeglioma figure B is high-degree glioma,the positive cells arebrown)(×400)

圖2 bcl-2蛋白在低級(jí)別及高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（EliVisionTM免疫組織化學(xué)染色）（×400倍）Figure 2 The expression of bcl-2 protein in glioma after immunohistochemical staining(figure a is low-degree glioma figure b is high-degree glioma ，the positive cells are brown)(×400)

有文獻(xiàn)報(bào)道[5]在相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)中，特異性COX-2抑制劑能夠抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性、促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞向星形細(xì)胞的分化。而Bcl-2則是一重要的凋亡抑制基因，其蛋白產(chǎn)物能抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存周期。已有學(xué)者進(jìn)行了體內(nèi)，體外膠質(zhì)瘤的blc-2的表達(dá)情況的研究[4-6]。c-erbB-2又稱neu基因，是1985年確認(rèn)的v-erbB-2相關(guān)的原癌基因，在先前的研究[7-9]也表明，無論是在基因?qū)用妫€是蛋白水平，c-erbB-2被證實(shí)在膠質(zhì)瘤上具有高表達(dá)性。在我們的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2，bcl-2在不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高其標(biāo)本陽性表達(dá)率和細(xì)胞陽性表達(dá)率均增高，特別在高級(jí)別膠質(zhì)瘤質(zhì)瘤中呈高表達(dá)。這些結(jié)果說明，COX-2，bcl-2的表達(dá)水平在一定程度上反映了膠質(zhì)瘤的惡性程度。c-cerbB-2的蛋白產(chǎn)物在膠質(zhì)瘤的表達(dá)，我們的實(shí)驗(yàn)中與正常腦組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因可能與樣本量有關(guān)，也與不同的實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。結(jié)合既往的研究論證[8-9]，c-cerbB-2可能參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生，但是可能與其惡性程度無明顯關(guān)聯(lián)，這需要今后更多的研究論證。

對(duì)于這三類蛋白之間的聯(lián)系及相互作用機(jī)制，目前仍無研究闡明。2002年，Ristimaki等[10]首次指出，乳腺癌中c-erbB-2與COX-2表達(dá)存在顯著相關(guān)性，亦有學(xué)者在轉(zhuǎn)染c-erbB-2基因的人乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白及PGE2存在高表達(dá)[11]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本相符。同樣也有學(xué)者報(bào)道發(fā)現(xiàn)在顱外腫瘤中[12-14]，COX-2與bcl-2表達(dá)存在著正相關(guān)性。這與我們實(shí)驗(yàn)中的所得出的結(jié)論相一致，因此，這些蛋白可能通過之間的相關(guān)作用促使腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生或者惡變。但其作用機(jī)制仍不清楚，王代旭等[15]報(bào)道認(rèn)為，bcl-2的表達(dá)有可能是COX-2的下游事件。但也有研究報(bào)道，COX-2抑制凋亡的機(jī)理還有其他途徑，例如減弱一氧化氮（NO）信號(hào)途徑和降低細(xì)胞間神經(jīng)鞘氨醇含量[16]。我們推測(cè)，可能是顱內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的原癌基因c-erbB-2的過渡表達(dá)，導(dǎo)致可COX-2蛋白高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)激活bcl-2的基因的的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受抑制，進(jìn)而引起膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)進(jìn)而惡變，這些作用機(jī)理需要今后的研究中進(jìn)一步完成。

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Investigation on relationship betwee the bcl-2,COX-2,c-erbB-2 protein expression and degree of malignant of human brain-glioma

Yu Nian-zu1,Xu Shan2,Xu Jiang1,Deng Sheng-ze1,Jiang Ze-sheng1,Yang Xuan-yong1
(1.Department of Neurosurgery,The FirstAffiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi,330006,China;2.Department of Pathology,The FirstAffiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi,330006,China)

Objective To explore the relationship between the bcl-2,COX-2,c-erbB-2 protein expression and degree of malignant of human brain-glioma.Methods Useing the immunohistochemical technique,bcl-2,COX-2,c-erbB-2 protein expression positive rate were determined in 10 no-tumor brain-tissue from brain-trauma patient who were executed the craniotomy decompression and 25 human low-degree(WHO 0-Ⅱ)and 25 hunman high-degre brain-glioma(WHOⅢ,Ⅳ)specimens of different malignant degresss confirm by pathology and immunohistochemistry separatively.Results bcl-2,COX-2,c-erbB-2 protein expression were not found in normal brain-tissue。the difference of bcl-2,COX-2 protein expressin positive rate were statistically significant in different group,but the c-erbB-2 protien expressin was no significant in three group.The relative analysis show the blc-2 were positively with the expressison rate of COX-2(r=0.682,P＜0.001);bcl-2 were positively with the expressison rate of c-erbB-2(r=0.308,P=0.03＜0.05);COX-2 were positively with the expressison rate of c-erbB-2(r=0.33,P=0.018＜0.05).Conclusion COX-2,bcl-2,c-erbB-2 were positively relative with each other,these factors were iinfluencee the malignant degree of Brian-glioma.

Brain-glioma;COX-2;bcl-2;c-erbB-2

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.36.024

江西省衛(wèi)生計(jì)生委會(huì)科技計(jì)劃項(xiàng)目（20155185）

楊玄勇，E-mail：docxuan@126.com