益氣溫陽護衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機制與防御素的相關性研究

余建瑋 洪 燕 湯志利 喻強強 葉 超

1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西總隊醫(yī)院門診部，江西南昌 330006

益氣溫陽護衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機制與防御素的相關性研究

余建瑋1洪 燕2湯志利1喻強強1葉 超1

1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西總隊醫(yī)院門診部，江西南昌 330006

目的研究與分析益氣溫陽護衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機制及與防御素的相關性。方法將240只SPF級雌性SD大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為6組，A組（正常對照組）、B組（模型組）、C組（卡介菌多糖核酸組）、D組（益氣溫陽護衛(wèi)低劑量組）、E組（益氣溫陽護衛(wèi)中劑量組）和F組（益氣溫陽護衛(wèi)高劑量組），每組各40只。分別于激發(fā)2周、4周、6周及8周各檢測6組大鼠的肺組織α防御素及β防御素表達情況。結果激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織α防御素及β防御素表達持續(xù)升高，且均高于A組，C～F組的表達均低于B組，D～F組的表達低于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論支氣管哮喘大鼠的肺組織防御素表達增強，益氣溫陽護衛(wèi)法對支氣管哮喘大鼠的防御素表達控制較好，因此在支氣管哮喘中的防治作用較好。

益氣溫陽護衛(wèi)法；支氣管哮喘；肺組織；防御素

近年來，世界各地支氣管哮喘的發(fā)病率和死亡率一直較高，且呈現(xiàn)呈逐年增高的趨勢[1]，因此臨床對于支氣管哮喘的重視程度極高。與支氣管哮喘相關的研究顯示，中藥近年來的臨床效果不斷受到肯定，其中益氣溫陽護衛(wèi)法的效果研究多見[2-3]，但是細致的防治機制及與防御素關系研究相對不足。本研究中我們就益氣溫陽護衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機制及與防御素的相關性進行探討與分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將240只SPF級雌性SD大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為6組，大鼠體重為200～220g。A組（正常對照組）、B組（模型組）、C組（卡介菌多糖核酸組）、D組（益氣溫陽護衛(wèi)低劑量組）、E組（益氣溫陽護衛(wèi)中劑量組）和F組（益氣溫陽護衛(wèi)高劑量組），每組各40只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備 制備哮喘動物模型，其中B～F組均為哮喘動物模型組，模型各組大鼠分別于第1天腹腔注射新鮮配制的卵蛋白氫氧化鋁溶液1mL(內(nèi)含卵蛋白10mg及氫氧化鋁200mg)致敏，并于第8天重復注射1次。自第15天起予以2%OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，每天1次，每次30min，分別持續(xù)2周、4周、6周及8周。分別于激發(fā)2周、4周、6周及8周各處死10只大鼠，每次分別處死正常大鼠、模型組大鼠、地塞米松組大鼠和蠲哮片（江中藥業(yè)股份有限公司，Z10960033）低、中、高組大鼠各5只，各組大鼠于末次霧化吸入后24h內(nèi)用1%戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，H31021724）1.0mL腹腔注射麻醉后，將其固定于手術臺上，肺組織以液氮凍存，抽提總RNA和蛋白，用于Realtime PCR、Western blot檢測。將肺組織采用SYBR Green Realtime PCR 技術檢測靶基因檢測α-防御素[人嗜中性白細胞肽(HNP)HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4和腸源性的潘氏細胞α-防御素(HD-5、HD-6)]及β-防御素 (HBD)[HBD-1、HBD-2、HBD-3和 HBD-4]等mRNA的表達。然后比較比較上述組別不同時間的檢測結果。

表1 6組大鼠不同時間的α-防御素mRNA表達比較（± s）

表1 6組大鼠不同時間的α-防御素mRNA表達比較（± s）

注：與A組比較①P＜0.05；與B組比較②P＜0.05；與C組比較③P＜0.05

組別 HNP-1 HNP-2 HNP-3 HNP-4 HD-5 HD-6 A組 2周 0.38±0.02 0.43±0.04 0.11±0.02 0.35±0.02 0.56±0.05 0.45±0.04 4周 0.40±0.03 0.44±0.06 0.13±0.02 0.37±0.02 0.55±0.07 0.47±0.05 6周 0.37±0.02 0.42±0.05 0.12±0.03 0.38±0.03 0.53±0.06 0.44±0.06 8周 0.41±0.04 0.43±0.05 0.11±0.03 0.36±0.03 0.55±0.06 0.45±0.06 B組 2周 0.82±0.08① 0.92±0.10① 0.62±0.08① 0.71±0.06① 1.12±0.11① 0.95±0.12①4周 0.90±0.09① 1.02±0.11① 0.70±0.10① 0.84±0.07① 1.28±0.14① 1.07±0.13①6周 1.06±0.11① 1.15±0.13① 0.75±0.10① 1.01±0.09① 1.42±0.15① 1.15±0.15①8周 1.21±0.15① 1.35±0.16① 0.81±0.13① 1.18±0.013① 1.61±0.17① 1.21±0.20①C組 2周 0.70±0.06①② 0.78±0.05①② 0.46±0.05①② 0.62±0.05①② 0.84±0.08①② 0.71±0.08①②4周 0.81±0.07①② 0.88±0.07①② 0.50±0.06①② 0.73±0.05①② 0.92±0.10①② 0.82±0.10①②6周 0.90±0.09①② 0.96±0.08①② 0.53±0.06①② 0.83±0.07①② 1.02±0.11①② 0.90±0.11①②8周 0.98±0.11①② 1.06±0.12①② 0.60±0.07①② 0.90±0.10①② 1.13±0.13①② 0.99±0.13①②D組 2周 0.58±0.05①②③ 0.62±0.05①②③ 0.35±0.04①②③ 0.52±0.04①②③ 0.77±0.07①②③ 0.65±0.07①②③4周 0.65±0.06①②③ 0.70±0.06①②③ 0.37±0.05①②③ 0.56±0.05①②③ 0.84±0.08①②③ 0.73±0.08①②③6周 0.72±0.08①②③ 0.77±0.09①②③ 0.41±0.05①②③ 0.68±0.06①②③ 0.96±0.10①②③ 0.83±0.10①②③8周 0.81±0.08①②③ 0.86±0.10①②③ 0.44±0.06①②③ 0.72±0.08①②③ 1.04±0.11①②③ 0.92±0.12①②③E組 2周 0.52±0.04①②③ 0.55±0.05①②③ 0.29±0.03①②③ 0.45±0.04①②③ 0.72±0.06①②③ 0.60±0.06①②③4周 0.56±0.05①②③ 0.60±0.06①②③ 0.30±0.04①②③ 0.48±0.05①②③ 0.81±0.07①②③ 0.65±0.07①②③6周 0.63±0.06①②③ 0.68±0.07①②③ 0.32±0.04①②③ 0.55±0.06①②③ 0.93±0.10①②③ 0.73±0.08①②③8周 0.72±0.07①②③ 0.77±0.08①②③ 0.33±0.04①②③ 0.60±0.06①②③ 0.98±0.11①②③ 0.84±0.08①②③F組 2周 0.42±0.03①②③ 0.44±0.03①②③ 0.22±0.02①②③ 0.41±0.04①②③ 0.68±0.08①②③ 0.55±0.05①②③4周 0.43±0.03①②③ 0.50±0.05①②③ 0.23±0.02①②③ 0.44±0.06①②③ 0.78±0.10①②③ 0.59±0.07①②③6周 0.48±0.05①②③ 0.56±0.06①②③ 0.25±0.03①②③ 0.46±0.07①②③ 0.88±0.09①②③ 0.66±0.08①②③8周 0.62±0.05①②③ 0.66±0.07①②③ 0.26±0.04①②③ 0.52±0.08①②③ 0.92±0.09①②③ 0.76±0.07①②③

1.2.2 益氣溫陽護衛(wèi)湯制備及應用 益氣溫陽護衛(wèi)湯的制備：將生黃芪、白術、防風、桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草、仙茅、仙靈脾等10味藥按比例2：1.5：1.5：1：1：1：1：0.5：1：1.5配伍，其中白術、防風、桂枝、白芍、生姜提取揮發(fā)油。然后取8倍量冷水浸藥半小時，第1煎1h（沸后）；第2煎加6倍量水煎40min，將兩次煎液，過濾合并濃縮，將提取物混合成合劑，分別調(diào)至含生藥2g/mL將各濃度溶液分別密封于無菌量瓶。將D組、E組及F組進行上述藥物應用，分別按 0.36g/kg、0.72g/kg、1.44g/kg的劑量對大鼠進行益氣溫陽護衛(wèi)湯藥液灌服，于每天霧化吸入OVA前1h應用。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 6組大鼠不同時間的α-防御素表達比較

激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織α防御素表達持續(xù)升高，且B～E組均高于A組（F=6.689，7.125，7.884，6.521，5.893，8.015），C ～ F組的表達均低于B組（F=7.025，6.864，7.223，6.569，7.846，8.113），D～F組的表達低于C組（F=5.996，5.843，6.110，6.423，5.978，5.642），激發(fā) 8 周 F 組的HNP-1高于A組（t=7.963），激發(fā)6周及8周F組HNP-2及 HNP-4高于 A 組（F=8.125，7.560），激發(fā)2周、4周、6周及8周F組HNP-3、HD-5及HD-6均高于 A 組（F=7.586，6.651，7.203），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），D組、E組及F組的上述指標表達有所差異，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表2 6組大鼠不同時間的β-防御素表達比較（± s）

表2 6組大鼠不同時間的β-防御素表達比較（± s）

注：與A組比較①P＜0.05；與B組比較②P＜0.05；與C組比較③P＜0.05

組別 HBD-1 HBD-2 HBD-3 HBD-4 A組 2周 0.32±0.03 0.44±0.05 0.41±0.04 0.31±0.04 4周 0.33±0.02 0.42±0.06 0.43±0.05 0.33±0.04 6周 0.35±0.04 0.43±0.07 0.39±0.05 0.32±0.05 8周 0.33±0.03 0.44±0.06 0.40±0.04 0.30±0.05 B組 2周 0.81±0.08① 0.95±0.10① 0.85±0.08① 0.78±0.10①4周 0.95±0.10① 1.12±0.13① 0.99±0.10① 0.95±0.13①6周 1.02±0.12① 1.19±0.16① 1.11±0.12① 1.02±0.15①8周 1.12±0.13① 1.23±0.18① 1.18±0.15① 1.06±0.15①C組 2周 0.65±0.07①② 0.71±0.07①② 0.66±0.07①② 0.60±0.06①②4周 0.72±0.08①② 0.82±0.09①② 0.75±0.09①② 0.70±0.08①②6周 0.80±0.10①② 0.91±0.10①② 0.82±0.11①② 0.81±0.09①②8周 0.89±0.11①② 0.96±0.12①② 0.92±0.12①② 0.86±0.11①②D組 2周 0.51±0.05①②③ 0.58±0.06①②③ 0.52±0.05①②③ 0.43±0.05①②③4周 0.56±0.06①②③ 0.58±0.08①②③ 0.56±0.05①②③ 0.46±0.06①②③6周 0.60±0.08①②③ 0.63±0.09①②③ 0.61±0.07①②③ 0.52±0.08①②③8周 0.63±0.08①②③ 0.72±0.11①②③ 0.66±0.07①②③ 0.58±0.08①②③E組 2周 0.48±0.04①②③ 0.56±0.05①②③ 0.50±0.04①②③ 0.42±0.05①②③4周 0.51±0.05①②③ 0.52±0.05①②③ 0.51±0.05①②③ 0.43±0.05①②③6周 0.56±0.06①②③ 0.56±0.07①②③ 0.57±0.05①②③ 0.47±0.06①②③8周 0.59±0.07①②③ 0.63±0.08①②③ 0.59±0.06①②③ 0.53±0.07①②③F組 2周 0.45±0.03①②③ 0.46±0.04①②③ 0.46±0.05①②③ 0.35±0.04①②③4周 0.48±0.05①②③ 0.50±0.05①②③ 0.48±0.06①②③ 0.41±0.05①②③6周 0.50±0.06①②③ 0.53±0.06①②③ 0.52±0.06①②③ 0.46±0.05①②③8周 0.52±0.06①②③ 0.56±0.06①②③ 0.55±0.07①②③ 0.50±0.06①②③

2.2 6組大鼠不同時間的β-防御素表達比較

激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織β防御素表達持續(xù)升高，且B～E組均高于A組（F=7.968，8.045，8.456，9.023），C ～ F 組的表達均低于 B 組（F=6.432，7.793，7.820，8.015），D ～ F組的表達低于 C 組（F=6.880，8.057，7.963，7.257），激發(fā)2周、4周、6周及8周F組HBD-1均高于A組（F=8.857），激發(fā) 6周及 8周 HBD-2、HBD-3及HBD-4 高于 A 組（F=7.663，6.541，6.823），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），D組、E組及F組的上述指標表達有所差異，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

支氣管哮喘在臨床多見，而與本病相關的治療研究多見，且中醫(yī)、西醫(yī)的治療效果多受肯定[4-5]。近年來，臨床對于中醫(yī)的研究占比不斷升高，且研究多顯示，中醫(yī)治療效果較好，中醫(yī)主要為通過調(diào)節(jié)患者全身的綜合機能狀態(tài)為目標，通過治療達到增強體質(zhì)，防御疾病的能力，因此在減少哮喘的發(fā)作甚至達到長期緩解等方面成為治療干預的重點[6-7]。益氣溫陽護衛(wèi)法是根據(jù)哮喘反復發(fā)作的內(nèi)因制定的治療方案，其從患者“氣陽虛弱、衛(wèi)氣不固”及“衛(wèi)氣根于下焦，滋養(yǎng)于中焦，宣發(fā)于上焦”等特點進行治療方案的制定與實施，從調(diào)補肺、脾、腎三臟之氣陽虛弱入手來達到調(diào)理機體的目的，從而實現(xiàn)提升呼吸道防御能力及免疫調(diào)節(jié)的作用。近年來臨床可見益氣溫陽護衛(wèi)法治療支氣管哮喘的療效[8-9]，但是對于其對哮喘細致的影響研究不足。

防御素是臨床中有效的抗菌殺菌物質(zhì)，且在介導獲得性免疫反應、調(diào)節(jié)機體的免疫炎癥反應和創(chuàng)傷修復過程中均有較強的作用，具有較高的穩(wěn)態(tài)維持作用[10-11]，有研究認為在支氣管哮喘中呈現(xiàn)顯著異常的表達，在幼稚樹突狀細胞趨化及炎癥聚集等方面均有反應意義，同時在肺損傷中具有反應價值[12-13]，因此其在支氣管哮喘患者中的變化及藥物對其影響的研究意義較高。

本研究就益氣溫陽護衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機制及與防御素的相關性進行觀察分析，結果顯示，支氣管哮喘大鼠的肺組織α-防御素及β-防御素均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且隨著激發(fā)時間的延長，其表達水平升高，均高于健康大鼠，同時益氣溫陽護衛(wèi)法治療大鼠的表達水平低于卡介菌多糖核酸干預大鼠，說明益氣溫陽護衛(wèi)法在支氣管哮喘大鼠中的調(diào)節(jié)治療作用更好，而隨著益氣溫陽護衛(wèi)湯劑量的加大，其表達水平雖有下降，但是不顯著，因此認為在藥物應用劑量方面應進一步給予重視與研究。分析研究結果，我們認為益氣溫陽護衛(wèi)法的應用使肺宣發(fā)肅降功能、脾之運化水濕功能、腎之蒸化水液功能均得到有效調(diào)節(jié)與改善，因此哮喘的控制作用得以凸顯[14-15]，而益氣溫陽護衛(wèi)法通過改善機體的陽氣虛弱及衛(wèi)氣不固等方面來達到實現(xiàn)防控慢性肺系病發(fā)病的作用，而其在放空的過程中有效激發(fā)了機體的自我防御機制，其中肺組織α-防御素及β-防御素表達增強，因此肺部保護作用凸顯，在降低炎性因素對呼吸系統(tǒng)的損傷的基礎上，對其修復作用也有促進作用，因此應用效果突出。

綜上所述，本研究認為支氣管哮喘大鼠的肺組織防御素表達增強，益氣溫陽護衛(wèi)法對支氣管哮喘大鼠的防御素表達控制較好，因此在支氣管哮喘中的防治作用較好。

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Study on the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin

YU Jianwei1HONG Yan2TANG Zhikli1YU Qiangqiang1YE Chao1
1.Lung Disease Department,the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangxi Provinical Corps Hospitial,Chinese People’s Armed Police Forces,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo study and analyze the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin.Methods240 female SD rats of grade SPF were divided into six groups,group A（normal control group）,group B（model group）,group C（BCG Polysaccharide and Nucleic Acid group）,group D（low dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,group E（middle dose of Yiqi Wenyang Huwei group）and group F（high dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,with 40 cases in each group according to the method of random number table.Then the expression situation of lung tissue α-defensins and β-defensins of six groups at second,forth,sixth and eighth week of provocation were detected.ResultsThe expression of lung tissue α-defensins and β-defensins of group B to group F at second,forth,sixth and eighth week of provocation were continuously increased,and they were all higher than those of group A,the expression of group C to group F were all lower than those of group B,the expression of group D to group F were lower than those of group C,there were all significant differences(P＜0.05).ConclusionThe lung tissue α-defensins expression of rats with bronchial asthma are intensive,so its prevention and treatment effect in the bronchial asthma is better.

Yiqi Wenyang Huwei method;Bronchial asthma;Lung tissue;Defensin

R259

A

2095-0616（2017）23-34-04

國家自然科學基金（81560767）；江西省自然科學基金（20132BAB215035）。

2017-10-30）