電化學(xué)發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物比較研究

周新媚 李秀華 李廣平 羅友軍

廣東省東莞三局醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523710

電化學(xué)發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物比較研究

周新媚 李秀華 李廣平 羅友軍

廣東省東莞三局醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523710

目的探討電化學(xué)發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的臨床效果。方法選擇2016年1月～2017年5月在我院因疑似乙型病毒性肝炎而行乙肝病毒標(biāo)志物檢查的患者200例為研究對(duì)象，200例同時(shí)采用電化學(xué)發(fā)光免疫法和采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行HBsAg檢測(cè)，比較兩種方法的HBsAg陽性率。取不同濃度HBsAg定值參比血清，用陰性血清進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)用兩種方法檢測(cè)，比較兩組最低檢出濃度。結(jié)果電化學(xué)發(fā)光免疫法HBsAg陽性率顯著高于ELISA方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度HBsAg靶值電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)的最低濃度顯著低于ELISA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物HBsAg比ELISA法陽性率高，最低檢出濃度更低，提示靈敏度更高。

電化學(xué)發(fā)光免疫法（ECLIA）；酶聯(lián)免疫法；乙肝病毒；HBsAg

乙型病毒性肝炎以肝炎性病變?yōu)橹鞯募膊。梢腋尾《靖腥緦?dǎo)致，除了肝臟受累，還可造成多器官損害。世界各國均有乙肝流行，兒童、青壯年是主要的受感染人群，部分患者會(huì)最終發(fā)展為肝硬化或者肝癌，乙型病毒性肝炎是目前嚴(yán)重威脅人類健康疾病，在我國也是目前流行最廣泛、危害性最嚴(yán)重的疾病。乙型病毒性肝炎一年四季均可發(fā)病，多為散發(fā)。目前臨床上檢測(cè)HBsAg、抗 -HBs、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc是篩查及確診乙型病毒性肝炎的主要指標(biāo)[1]。本研究比較電化學(xué)發(fā)光免疫法與酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2017年5月在我院因疑似乙型病毒性肝炎而行乙肝病毒標(biāo)志物檢查的患者200例為研究對(duì)象， 200例同時(shí)采用電化學(xué)發(fā)光免疫法和采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行HBsAg檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：無嚴(yán)重黃疸或者脂血、溶血。患者對(duì)本次研究知情同意。200例患者中男124例，女76例，平均年齡（41.4±10.3）歲。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集患者空腹肘靜脈血2管各3mL（一管用于ELISA法，另一管用于電化學(xué)發(fā)光免疫法）。室溫放置20min，3000轉(zhuǎn)/min離心5min，對(duì)血清進(jìn)行檢測(cè)，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 ELISA法 試劑盒由中山生物有限公司提供，儀器為：酶標(biāo)儀（賽默飛熱電）、加樣槍、電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫法 試劑盒由羅氏公司提供，儀器為：羅氏2010全自動(dòng)免疫分析儀。

1.3 結(jié)果判斷[2]

ELISA法：臨界值（CO值）=2.1×N（陰性對(duì)照均值），N＜0.05時(shí)按0.05計(jì)算，樣本OD值＜CO值為陰性，樣本OD值≥CO值為陽性。電化學(xué)發(fā)光免疫法：＜1.00為陰性， ≥1.00為陽性。比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度，取不同濃度HBsAg定值參比血清，用陰性血清進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)用兩種方法檢測(cè)，比較兩組最低檢出濃度，每個(gè)濃度HBsAg靶值檢測(cè)5次，計(jì)算（）用于比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS15.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)乙肝病毒HBsAg標(biāo)志物陽性率比較

電化學(xué)發(fā)光免疫法HBsAg陽性率62.0%（124/200），顯著高于ELISA方法47.0%（94/200），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.479，P＜0.05）。

2.2 兩種方法檢測(cè)不同濃度HBsAg靶值最低檢測(cè)濃度比較

不同濃度HBsAg靶值電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)的最低濃度顯著低于ELISA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 兩種方法檢測(cè)不同濃度HBsAg靶值最低檢測(cè)濃度比較（± s，ng/mL）

表1 兩種方法檢測(cè)不同濃度HBsAg靶值最低檢測(cè)濃度比較（± s，ng/mL）

組別 n 0.1 0.3 0.7 ECLIA 200 0.11±0.02 0.21±0.04 0.65±0.08 ELISA 200 1.28±0.05 2.02±0.06 2.79±0.10 t 307.26 354.97 236.32 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

乙型肝炎病毒簡(jiǎn)稱乙肝病毒。是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae）。乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鳎⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種疾病。我國是乙型病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)。全世界有20億人感染過HBV，大約3.5億為慢性HBV感染者，75%為亞洲人，25%～33%患肝硬化或者肝癌，每年大約100萬人死于HBV感染，為人類死亡原因的第9位。乙肝病毒性感染由乙肝病毒引起，以肝臟病變?yōu)橹饕膫魅静　；颊咧饕憩F(xiàn)為食欲不振、惡心、嘔吐、厭油膩、腹脹、腹瀉、乏力、肝區(qū)疼痛、肝脾腫大、黃疸等。HBV抗原抗體系統(tǒng)中，表面抗原抗體系統(tǒng)HBsAg有抗原性，無傳染性，HBsAb為保護(hù)性抗體，但低滴度時(shí)仍可受染；核心抗原抗體系統(tǒng)中HBcAg有抗原性及感染性，但在血液中難以檢測(cè)出，HBcAb為非保護(hù)性抗體，為病毒復(fù)制的指標(biāo)，HBcAb IgM表示新近感染或慢性急性活動(dòng)；e抗原抗體系統(tǒng)中HBeAg是病毒復(fù)制和傳染性的重要指標(biāo)，HBeAb是病毒復(fù)制已經(jīng)減少，傳染性降低。分子生物學(xué)標(biāo)記物HBV-DNAP、HBV-DNA是病毒復(fù)制及傳染性的指標(biāo)[3-4]。

目前臨床上常用的乙肝血清學(xué)檢查項(xiàng)目包括HBsAg、抗 -HBs、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc。免疫分析法是基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段；免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既容易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或者抗體的性質(zhì)與含量[5-6]。ELISA方法是在固相載體表面吸附抗原或者抗體，在固相載體表面行酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)，可檢測(cè)大分子抗原、特異性抗體，具有靈敏、快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。瑞典學(xué)者于1971年報(bào)道了ELISA檢測(cè)方法，目前這種方法已經(jīng)成為分析化學(xué)領(lǐng)域前言課題，是在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型免疫檢測(cè)技術(shù)[9-10]。ELISA方法采用抗原、抗體特異反應(yīng)連接待測(cè)物與酶，酶與底物發(fā)生顏色反應(yīng)，用于定性、半定量測(cè)定。ELISA檢測(cè)的指標(biāo)可以抗體也，也可以使抗原[11-12]。ELISA方法檢測(cè)有3種試劑，免疫吸附劑（固相抗原或者抗體），標(biāo)記物（酶標(biāo)記的抗原或者抗體），顯色劑（底物）。檢測(cè)時(shí)抗原或者抗體固相載體上結(jié)合，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體或者抗原與酶結(jié)合的偶聯(lián)物，即標(biāo)記物，偶聯(lián)物保留免疫活性以及酶活性，其與固相載體上的抗原或者抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，加上酶的底物，發(fā)生催化水解或者氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)后呈現(xiàn)的顏色深淺與待測(cè)的指標(biāo)含量有關(guān)，可用肉眼、顯微鏡進(jìn)行觀察，也可用酶標(biāo)儀測(cè)定，得出定性或者半定量的結(jié)果。這種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，具有較強(qiáng)的特異性。ELISA又被稱為酶放大體系，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或者亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或者抗體的位置，或者在微克，甚至是納克水平上進(jìn)行半定量檢測(cè)。ELISA方法的特異性依賴的是抗體或者抗原的選擇性。

電化學(xué)發(fā)光方法是來源于電化學(xué)法與化學(xué)發(fā)光法，化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)由化合物混合啟動(dòng)，電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)由電啟動(dòng)，與前者相比，更容易控制，精確度更高[13]。電化學(xué)發(fā)光免疫法是一種新技術(shù)，結(jié)合了電化學(xué)發(fā)光與免疫測(cè)定方法[14-15]。電化學(xué)發(fā)光劑是在工作電極陽極上施加電壓能量，二價(jià)三氯聯(lián)吡啶釕釋放電子，發(fā)生反應(yīng)，成為三價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕；同時(shí)電極表面的TPA釋放電子，發(fā)生氧化反應(yīng)，成為陽離子自由基，迅速組發(fā)脫去一個(gè)質(zhì)子，形成三丙胺自由基，整個(gè)反應(yīng)體系存在具有強(qiáng)氧化性的三價(jià)三氯聯(lián)吡啶釕與強(qiáng)還原性的三丙胺自由基TPA。兩者發(fā)生氧化還原反應(yīng)，三價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕還原為二價(jià)的激發(fā)態(tài)，能連過來源于三價(jià)三氯聯(lián)吡啶釕與三丙胺自由基TPA的電勢(shì)差，激發(fā)態(tài)的三氯聯(lián)吡啶釕以熒光機(jī)制衰變，釋放波長為620nm光子能量，成為基態(tài)。電化學(xué)發(fā)光免疫法反應(yīng)面積大，吸附率高，反應(yīng)速度快，靈敏度高，操作方便，標(biāo)記物可再循環(huán)利用。電化學(xué)發(fā)光免疫法的敏感度高，可達(dá)pg/mL或者pmol/mL水平，還具有特異性強(qiáng)，測(cè)定范圍好，可重復(fù)性好，在許多國家，其已經(jīng)成為首選的檢測(cè)方法。在本次研究中結(jié)果提示，ECLIA方法在對(duì)HBsAg的檢測(cè)陽性率顯著高于ELISA方法，提示通過ECLIA方法檢測(cè)能夠減少漏診率。取不同濃度HBsAg定值參比血清，進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定兩種方法的最低檢出濃度，結(jié)果提示，ECLIA方法的最低檢測(cè)濃度均顯著低于ELISA方法，說明ECLIA方法具有更高的靈敏性。

綜上所述，電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物HBsAg比ELISA法陽性率高，最低檢出濃度更低，提示靈敏度更高。

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Comparative study on detection of HBV markers by electrochemiluminescence immunoassay and enzyme linked immunosorbent assay

ZHOU Xinmei LI Xiuhua LI Guangping LUO Youjun
Department of clinical laboratoryDongguan three Bureau hospital, Dongguan Guangdong,China

ObjectiveTo explore the clinical effect of electrochemiluminescence immunoassay and enzyme linked immunosorbent assay in detection of hepatitis B virus markers.Methods200 patients of suspected hepatitis B with Hepatitis B virus markers test in our hospital from January 2016 to May 2017 were selected as subjects.200 cases were detected by electrochemiluminescence immunoassay and enzyme linked immunosorbent assay (HBsAg).The positive rates of HBsAg were compared between the two methods.Different concentrations of HBsAg reference serum were selected,serum dilution was performed with negative serum,and two methods were used to detect the minimum detectable concentration of the two groups.ResultsThe positive rate of HBsAg by electrochemiluminescence immunoassay was significantly higher than that by ELISA method,the difference was statistically significant(P＜0.05).The lowest concentration of HBsAg target with different concentrations of electrochemiluminescence immunoassay was significantly lower than that of ELISA group, the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe positive rate of hepatitis B virus marker HBsAg detected by electrochemiluminescence immunoassay was higher than that by ELISA assay,the lowest detection concentration is lower,indicating higher sensitivity.

Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA);Enzyme linked immunosorbent assay;Hepatitis B virus;HBsAg

R446.62

A

2095-0616（2017）23-116-03

2017-08-17）