黃酒麥曲中產凝乳酶菌株的分離鑒定

李柳，鄭喆，趙笑，曹永強，余志堅，陳超，楊貞耐,

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京工商大學，北京 100048；2.東君乳業（禹城）有限公司，山東禹城 251200）

黃酒麥曲中產凝乳酶菌株的分離鑒定

李柳1，鄭喆1，趙笑1，曹永強2，余志堅2，陳超2，楊貞耐1,2

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心北京工商大學，北京 100048；2.東君乳業（禹城）有限公司，山東禹城 251200）

本研究利用梯度稀釋法和劃線純化法對黃酒麥曲中的微生物進行初篩，再利用酪蛋白平板法和液態培養基發酵法進行復篩，最終得到了兩株產凝乳酶的優良細菌菌株LB-1和LB-2。通過形態學特征觀察、生理生化實驗以及16S rDNA序列分析鑒定，這兩株菌分別確定為甲醇芽孢桿菌(Bacillus methanolicus)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。根據凝乳活力曲線發現，這兩株菌在發酵24 h時其發酵液的凝乳活力最高，分別為269.66±0.78 SU/mL和187.50±1.4 SU/mL，此時的蛋白水解活力分別為1.476±0.49 U/mL和1.29±1.41 U/mL，凝乳活力與蛋白水解活力比值(C/P)分別為187.50和145.34。通過凝乳效果評價，其發酵液所形成的凝塊組織結構、質構參數和風味物質均與商品凝乳酶形成的凝塊相當，適用于干酪的加工。

黃酒麥曲；凝乳酶；分離；鑒定；凝乳效果評價

0 引言

凝乳酶在干酪加工過程中起凝固作用[1]。最早的來源是小牛皺胃，但隨著干酪需求量的增加，屠宰大量犢牛已經不能滿足人類的需求，而且引發了一些倫理問題[2]。目前報道產凝乳酶的來源有動物源、植物源以及微生物源[3]，由于微生物生長繁殖迅速、發酵周期短的特點，已經成為凝乳酶生產的主要來源[4]。

黃酒分為南方黃酒和北方黃酒，南方黃酒有名的是紹興黃酒[5]，北方黃酒典型代表是北宗黃酒.。近年來科研工作者對南方黃酒麥曲中的微生物進行了鑒定[6]，對北方黃酒麥曲中的微生物研究很少。

本研究從北宗黃酒麥曲中篩選出了產凝乳酶的菌株，通過形態學觀察、生理生化實驗以及16S rDNA分子生物學進行了鑒定[7]，對其發酵液形成的凝塊進行了質構和風味分析[8]。

1 實驗

1.1 材料

黃酒麥曲，脫脂乳粉，商品凝乳酶。

1.2 培養基的配制

LB固體培養基（均為質量濃度）：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，121℃高壓滅菌20 min。LB液體培養基：不添加瓊脂粉即可。YEPD培養基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 L，pH值為6.0，115℃濕熱滅菌20 min。PDA培養基：馬鈴薯浸粉15 g/L，葡萄糖3 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，121℃高壓滅菌20 min。酪蛋白培養基：蛋白胨2.5 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏1 g/L，干酪素10 g/L，瓊脂粉20 g/L，脫脂牛乳50 g/L，pH 7.0，95 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設備

HWS 12恒溫水浴鍋，Axio Image A1顯微鏡，分光光度計U-3900，HZQ-Q氣浴恒溫搖床，全自動凝膠成像系統，TexturePro CT V1.8 Build 31質構儀，GC-MS 7890A-7000。

1.4 方法

1.4.1 產凝乳酶菌株的初篩[9]

準確稱取0.5 g粉碎好的麥曲加入裝有4.5 mL無菌生理鹽水的試管中，在振蕩器中混勻，使麥曲均勻的分散在無菌生理鹽水中，制得的該樣品稀釋度為10-1。然后將樣品依次進行10倍梯度稀釋，直到稀釋度為10-7，各取100 μL（10-3～10-7）的稀釋液分別涂布于LB，YEPD和PDA三種固體培養基中，實驗重復三次。然后將培養基倒置于30℃恒溫培養箱中進行培養，在第2，3，4天時挑取少量形態大小不同的菌落接種于相應的固體培養基中進行分離純化，直至得到單菌株。分離純化后將編好號的單菌株保存在甘油管中。

1.4.2 產凝乳酶菌株的復篩[10]

將初篩中得到的單一菌株以三點法接種于酪蛋白固體培養基中，在37℃恒溫培養2 d，觀察不同菌株產凝乳圈和水解圈的情況。取少量產凝乳圈和水解圈的菌株分別接種于LB、YEPD和PDA三種不同液體培養基中，30℃轉速為120 r/min振蕩培養24 h后分別測定菌株發酵液的凝乳活力和蛋白水解活力。

1.5 產凝乳酶菌株的鑒定

1.5.1 菌體形態觀察

將分離得到的產凝乳酶菌株分別接種于LB固體培養基上，放在37℃恒溫培養24 h后先通過肉眼觀察菌落生長情況，再通過革蘭氏染色后在顯微鏡下進一步觀察菌體形態。

1.5.2 API試劑盒法對菌株的生理生化特征分析

用無菌棉簽將平板培養好的新鮮菌體全部挑取置含有1 mL無菌生理鹽水的試管中制成濃的細菌懸液，加兩滴該菌液接種于API 50CHB/E培養基的安甁中，然后分別加入API 50CHB試劑盒各孔內，37℃靜置培養24 h和48 h，通過觀察試劑盒各孔顏色的變化來確定各反應結果的陰陽性，其中紅色代表反應結果陰性，黃色和黑色代表反應結果陽性。

1.5.3 基于16S rDNA基因的菌種分子生物學鑒定

產凝乳酶菌株全基因組DNA的分離純化：將產凝乳酶菌株分別接種于LB液體培養基中，30℃轉速為120 r/min振蕩培養12 h后離心，利用細菌基因組DNA提取試劑盒對其全基因組DNA進行提取。并利用提取的DNA作為PCR反應的模板，采用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR擴增[11]。

50 μL PCR反應體系：25 μL 2×Taq PCR Master?Mix(with loading dye)；2 μL全基因組DNA模板；2 μL 27F(10umol/L)；2 μL 1492R(10 umol/L)；19 μL ddH2O。

PCR擴增程序：95℃預變性3 min，95℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，35個循環，72℃末端延伸5 min，擴增結束后將產物放在-20℃冰箱中保存。用質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增是否成功，將有特異性條帶的PCR產物送至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。測序結果提交到GenBank中，選取與實驗菌株序列大小相近的已知菌株的相應序列進行比對，利用MEGA6.0軟件將實驗菌株與選取的序列相似性較高的菌株序列進行分析，構建系統發育進化樹[12]。

1.6 產凝乳酶菌株發酵液活力的測定

1.6.1 凝乳活力的測定

凝乳活力測定采用Arima[13]方法，將脫脂乳溶解在濃度為0.01 mol/L的CaCl2溶液中制成10%的脫脂乳溶液，室溫下靜置30 min后各量取5 mL分裝到小試管中，于35℃恒溫水浴箱中保溫5 min，在35℃下取待測菌液0.5 mL加入到5 mL裝有10%脫脂乳溶液的試管中搖勻后開始計時，當開始出現絮狀沉淀時立即停止計時。計算公式為

式中：MCA為發酵液凝乳活力(SU/mL)；V1為脫脂牛奶溶液體積（mL）;t為凝乳時間（s）；V2為所加菌液體積（mL）；n為菌液稀釋倍數。

1.6.2 蛋白水解活力的測定[14]

將2 mL質量分數為1.5%酪蛋白溶液在35℃中保溫5 min后，加入0.5 mL在35℃預熱好的產凝乳酶菌株發酵液，將兩者混勻在35℃中保溫60 min，加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應，用濾紙將沉淀過濾出去測定濾液在280 nm處的吸光度值A280。量取0.5 mL在35℃預熱好的產凝乳酶菌株發酵液直接與8%的三氯乙酸混勻，再加入2 mL質量分數為1.5%酪蛋白溶液，過濾后取濾液作為空白對照，測定其在280 nm處的吸光度值A280'。計算公式為：

式中：PA為發酵液蛋白水解活力(U/mL)。

1.7 產凝乳酶菌株生長曲線及其發酵液的凝乳活力曲線的測定

1.7.1 生長曲線的測定

取少量產凝乳酶菌株接種于LB液體培養基中，30℃轉速為120 r/min振蕩培養，每隔3 h測定菌體OD600值，直至菌株生長到衰亡期，實驗重復3次。

1.7.2 凝乳活力曲線的測定

取少量產凝乳酶菌株接種于LB液體培養基中，30℃轉速為120 r/min條件下振蕩12 h，作為活化種子液，以質量分數為3%的接種量接種于LB液體培養基中，裝液量為40%(體積分數)，在30℃轉速為120 r/min下振蕩培養，分別在0，12，24，36，48，60，72，84 h時，按照1.6.1和1.6.2方法測定產凝乳酶菌株發酵液的凝乳活力和蛋白水解活力，實驗重復3次。

1.8 產凝乳酶菌株發酵液的凝乳效果評價

1.8.1 凝乳效果及質構分析

在凝乳活力曲線中產凝乳酶菌株的最適發酵條件下測定其發酵液的凝乳活性，將酶活力為3.5×105SU/g的商品凝乳酶稀釋1 000倍作對照，按照1.6.1的方法分別添加相同量的商品酶與菌株發酵液的離心上清液測定其凝乳時間，并利用TexturePro CT V1.8 Build 31質構儀對凝塊進行質構分析，轉子直徑20 mm，目標距離5.0 mm，觸發點負載5.0 g，測試速度為0.5 mm/s，返回速度為0.5 mm/s，循環2次。目的是分析比較產凝乳酶菌株發酵液和商品凝乳酶形成凝塊的硬度、黏性、彈性、內聚性、膠著性和咀嚼性。

1.8.2 持水力測定

按照1.6.1的方法分別添加相同量的商品酶與產凝乳酶菌株發酵后的離心上清液至裝有5 mL脫脂乳溶液的離心管中，凝乳后進行離心操作，在轉速為7 000 r/min，溫度為4℃條件下，離心10 min。離心完成后取上清稱重，代入公式算得凝塊持水力，即

1.8.3 風味物質分析

GC-MS法分析對比產凝乳酶菌株發酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成的凝塊風味。量取9 mL脫脂乳溶液加入到50 mL萃取瓶中，分別加入1 mL的菌株發酵后的離心上清液和稀釋后的商品凝乳酶，蓋好蓋子后放在40℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，將進樣針插入萃取瓶中40℃吸附30 min后，拔出進樣針插入氣相色譜進樣口中，250℃條件下解析5 min。

（1）GC條件程序升溫：初始溫度為40℃，保持3 min，然后以5℃/min升溫到200℃，保持0 min，再以10℃/min升溫到250℃，保持3 min后運行3 min。載氣(He)，恒定流速為1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1。

（2）質譜條件電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，質量掃描范圍m/z為40～250。

2 結果與分析

2.1 產凝乳酶菌株的篩選

利用梯度稀釋法和劃線分離法從黃酒麥曲中分離純化得到14株不同菌落形態的純種菌株，將分離純化得到的14株菌株分別以三點法點接于酪蛋白平板上[15]，通過觀察得到兩個產生凝乳圈的菌株LB-1和LB-2，其菌體形態如圖1所示。

圖1 LB-1與LB-2菌株在酪蛋白平板上的菌落形態

由圖1可以看出，LB-1與LB-2兩株菌均產生較大的凝乳圈以及周圍的一些水解圈，且LB-1菌株比LB-2菌株的沉淀圈更厚重。將這兩株菌分別接種于LB,YEPD和PDA三種不同的液體培養基中，在30℃120 r/min振蕩培養24 h，測定其發酵液的凝乳活力和蛋白水解活力，結果如表1所示。

表1 LB-1與LB-2菌株在不同培養基中發酵的凝乳活力比較菌株

由表1可以看出，兩株菌的發酵液均在液體LB培養基中凝乳活力相對較高。其中LB-1菌株發酵液在液體LB培養基中凝乳活力高達296.66 SU/mL，且蛋白水解活力較低；LB-2菌株發酵液在液體LB培養基中凝乳活力為193.65 SU/mL，相對較高。

2.2 產凝乳酶菌株的鑒定

2.2.1 形態學特征

將LB-1與LB-2菌株在LB固體平板上培養24 h后觀察其菌落形態有明顯差異，LB-1菌株呈乳白色、不透明、不光滑、較干燥；LB-2菌株稍顯黃色、有褶皺、表面較濕潤。通過革蘭氏染色確定LB-1菌株與LB-2菌株均為革蘭氏陽性反應，在顯微鏡下放大倍數為40倍時觀察LB-1菌株為長桿狀，LB-2菌株為短桿狀。菌株形態及革蘭氏染色照片分別如圖2和圖3所示。

圖2 LB-1菌株菌落形態及革蘭氏染色照片

圖3 LB-2菌株菌落形態及革蘭氏染色照片

2.2.2 API試劑盒法分析菌株生理生化特征

LB-1和LB-2菌株的API試劑盒發酵結果如表2所示。表2中，+為反應結果為陽性；－為反應結果為陰性。

表2 LB-1和LB-2菌株的API生化試劑盒發酵結果

將API試劑條發酵結果提交到apiweb軟件中進行比對鑒定，結果顯示LB-2菌株與枯草芽孢桿菌相似度高達91.6%，可初步斷定其為枯草芽孢桿菌，由于API數據庫所含菌株數量有限，未能將LB-1菌株準確鑒定到種，但根據其主要糖反應結果并參考伯杰式細菌鑒定手冊[16]可初步確定其為芽孢桿菌屬，后續可通過分子生物學實驗進一步鑒定。

2.2.3 基于16S rDNA序列的分子生物學鑒定

以LB-1和LB-2菌株全基因組DNA為模板進行PCR擴增后的產物再通過質量分數為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，LB-1和LB-2菌株在約1 500 bp處各有一條特異性條帶，如圖4所示。

圖4 LB-1和LB-2菌株的16S rDNA 1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

PCR產物測序結果表明，LB-1菌株的16S rDNA序列長度為1 428 bp，LB-2菌株的16S rDNA序列長度為1 445 bp。

2.2.4 基于16S rDNA序列相似性比對及系統發育樹分析

分別將LB-1和LB-2菌株的16S rDNA基因序列與在GenBank中序列大小相近的已知菌株的序列進行比對后，選取與LB-1和LB-2菌株序列相似性較高的菌株序列，構建系統發育樹，結果如圖5和圖6所示。由圖5和圖6可以看出，LB-1菌株與Bacillus meth?anolicusPB1(AFEU01000004.1)在同一分支上，LB-2菌株與Bacillus subtilis strain P3(KF758384.1)在同一分支上且它們的置信度支持率分別高達99%和100%，綜合上述形態學和生理生化實驗結果可將LB-1菌株鑒定為甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)，將LB-2菌株鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

圖5 以16S rDNA序列為基礎的LB-1菌株系統發育樹

圖6 以16S rDNA序列為基礎的LB-2菌株系統發育樹

2.3 菌株的生長曲線及其發酵液的凝乳活力曲線測定結果

甲醇芽孢桿菌LB-1的生長曲線和發酵液的凝乳活力曲線如圖7所示。由圖7(a)可知，OD600值顯示LB-1菌株在液體培養基中0～6 h生長速率緩慢，這個時期為遲緩期；6～21 h菌株生長迅速，這一階段為指數期；21～45 h菌株生長速率隨時間延長基本保持不變，這一階段為穩定期；45 h以后菌株生長速率急速下降，這一階段為衰亡期。由圖7(b)可知，LB-1菌株發酵液在對數期凝乳活力快速增加，在穩定期凝乳活力也趨于穩定且在穩定初期凝乳活力達到最大值，隨后凝乳活力開始下降，可能原因是培養基中營養成分消耗殆盡以及處于衰亡期的菌株生長速率下降導致其凝乳活力的下降。隨著發酵時間的增加蛋白水解活力總體差異不大，特別在發酵24 h時，菌株發酵液的凝乳活力達到最大值隨后開始逐漸下降，但其蛋白水解活力相對較小，凝乳活力與蛋白水解活力比值(C/P)為最大值。

圖7 LB-1的生長曲線和發酵液的凝乳活力曲線

枯草芽孢桿菌LB-2的生長曲線及其發酵液的凝乳活力曲線分別如圖8(a)和8(b)所示。由圖8(a)可知，OD600值顯示LB-2菌株在液體培養基中0～6 h生長速率緩慢，這個時期為遲緩期；6～21 h菌株生長迅速增加，這一階段為指數期；21～27 h菌株生長隨時間增加基本保持不變，這一階段為穩定期，與圖7(a)相比，LB-2菌株穩定期相對較短；27 h以后菌株生長速率急速下降，這一階段為衰亡期。由圖8(b)可知，LB-2菌株發酵液在0～24 h凝乳活力迅速增加，在24 h達到最大值后開始下降且在發酵24 h時LB-2菌株發酵液的C/P值最大。

圖8 枯草芽孢桿菌LB-2的生長曲線和凝乳活力曲線

2.4 產凝乳酶菌株發酵液所形成凝塊的凝乳效果評價

2.4.1 凝乳效果及質構分析結果

對比甲醇芽孢桿菌LB-1和枯草芽孢桿菌LB-2與稀釋后的商品凝乳酶形成的凝塊如圖9所示。

圖9 LB-1與LB-2菌株發酵液的凝乳效果

其中LB-1菌株發酵后的離心上清液凝乳時間為98 s，即凝乳活力為244.89 SU/mL，LB-2菌株發酵后的離心上清液凝乳時間為113 s，即凝乳活力為212.39 SU/mL，酶活力為3.5×105SU/g的商品凝乳酶稀釋1 000倍后凝乳時間為96 s，即凝乳活力為250 SU/mL。LB-1與LB-2菌株發酵液的凝乳活力與商品凝乳酶很接近。

為了進一步比較甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2發酵后的離心上清液與商品凝乳酶形成凝塊的硬度、黏性、彈性、內聚性、膠著性、咀嚼性，分別對其進行了質構分析[17]，所形成凝塊的質構分析結果如表3所示。硬度是第一次壓縮時的最大峰值，正的力值和面積越大說明凝塊越硬，其中商品凝乳酶所形成的凝塊硬度最大為（309.25±0.05）g，LB-1菌株發酵液所形成的凝塊硬度居中為（287.85±0.17）g，LB-2菌株發酵液所形成的凝塊硬度最小為（246.35±0.13）g，但三者差異不顯著(P＞0.05)，所測硬度指標以第一次硬度為主，因為第二次所測硬度可能會受到第一次測量的影響[18]。黏性是第一次圧縮曲線到達零點到第二次圧縮曲線開始之間的曲線的負面積，LB-2菌株發酵液所形成的凝塊黏性最大,數值為（0.055±0.13）mJ。黏性越大的樣品活塞上提時粘在探頭上的越多，一般較稠的凝塊黏性越大，膠著性也主要是描述半固態測試樣品的黏性特征。彈性是變形樣品在去除壓力后恢復到變形前的高度比率，LB-2菌株發酵液所形成的凝塊硬度最低其彈性最大。而內聚性越大，說明樣品對活塞下壓時抵抗力越大[19]，也說明凝塊爽滑性、細膩度越差，酒曲菌株發酵液形成的凝塊內聚性分別為0.44±0.06和0.49±0.03，小于對照組0.565±0.26，所以酒曲菌株發酵液形成的凝塊其細膩度優于對照組。

表3 LB-1與LB-2菌株發酵液所形成凝塊的質構分析各指標結果

通過整體比較分析，LB-1與LB-2菌株發酵液所形成的凝塊質構特性與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

2.4.2 持水力分析結果

為了進一步評價甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2在干酪制作中的應用潛力，考察其發酵后的離心上清液所形成的凝塊阻止水滲出的能力，分別測定了菌株發酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的持水力，結果如表4所示。

表4 LB-1與LB-2菌株發酵液所形成凝塊的持水力測定結果

持水力描述的是由分子構成的機體通過物理方式截留大量的水而阻止水滲出的能力。持水力越大說明機體內固定住的水分越多，凝乳質量越好。由表4可得，酒曲菌株發酵液與商品凝乳酶所形成凝塊的持水力數值均較高，且主體間效應檢驗結果表明三者差異不顯著(P＞0.05)。綜合凝塊的質構特性和持水性能進行分析，酒曲菌株發酵液所形成凝塊的細膩度、爽滑性優良，持水力高，可用于干酪的生產。

2.4.3 風味物質分析結果

通過GC-MS分析甲醇芽孢桿菌LB-1與枯草芽孢桿菌LB-2發酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的風味物質[20]如圖10所示。

圖10 LB-1與LB-2菌株發酵后的離心上清液所形成凝塊的風味物質

根據圖中LB-1與LB-2菌株發酵后的離心上清液和商品凝乳酶所形成凝塊的出峰圖譜進行解析，商品凝乳酶形成的凝塊中的主要風味物質為辛醛、壬醛、癸醛和庚醛，LB-1菌株發酵液的凝塊中主要風味物質為辛醛、壬醛、癸醛和庚醛，LB-2菌株發酵液的凝塊中主要風味物質為辛醛、壬醛、癸醛和十三烷，三種凝塊中均不含異味，且主要風味物質均為醛類。醛類物質的閾值一般較低，對食品整體風味的貢獻較大[21],壬醛普遍存在于干酪中，具有脂肪味和水果的香味。而LB-2菌株發酵液凝塊中的十三烷為烴類化合物，主要來源是牛乳本身，并不是在干酪成熟過程中產生的，因此其在所有干酪中的存在較為普遍，但一般由于烴類化合物的芳香閾值較高，這些化合物對干酪風味的貢獻較小[22]。后期利用LB-1與LB-2菌株所產的凝乳酶制作干酪，其產品的風味得到了保障。

3 結果與討論

（1）同樣作為凝乳酶的生產者，微生物與動植物相比有體積小，繁殖快，生長周期短，發酵產物易提取等優勢[23]，因此研究微生物用于生產凝乳酶具有很好的發展前景[24]。Bensmail等利用農副產品作為營養物質通過固態發酵法優化了黑曲霉生產的細胞外蛋白酶凝乳活性的最佳條件[25]，張衛兵等對解淀粉芽孢桿菌產凝乳酶條件進行了優化并對其分離提純做了詳細研究[26]，均指出其微生物產凝乳酶穩定，具有大規模生產凝乳酶的潛力。

（2）本研究對黃酒麥曲中的微生物進行分離鑒定，最終篩選出了兩株產凝乳酶的細菌，分別是甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，與同來源于酒曲中的真菌相比具有發酵易于控制，產物易于提取分離等優勢，而且根據其凝乳活性曲線，LB-1與LB-2菌株均在發酵24 h時其發酵液凝乳活力達到最大值（269.66±0.78）SU/mL和（187.50±1.4）SU/mL，此時的蛋白水解活力分別為（1.476±0.49）U/mL和（1.29±1.41）U/mL，凝乳活力與蛋白水解活力比值分別為187.50和145.34。目前已報道的產凝乳酶細菌菌株中解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)在發酵72 h時其發酵液凝乳活力達到最大值，此時C/P為85.45[27]，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)在最佳發酵條件下發酵10 h發酵液的凝乳活力最大僅為24.7 SU/mL[28]。從黃酒麥曲中篩選出的LB-1和LB-2菌株與其相比，不僅發酵周期短而且C/P高。此外，LB-1和LB-2菌株發酵液形成的凝塊與商品凝乳酶形成的凝塊相比其彈性、硬度、黏性、內聚性等均無明顯差異，所含風味物質也基本相同，且無異味存在。

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)近些年報道產凝乳酶的文章較多[29]，而關于甲醇芽孢桿菌(B.Methanolicus)鮮有報道。曾有研究表明[30]它的最適生長溫度為55℃，是典型的嗜熱菌株，且能以甲醇為原料合成自身所需營養物質，并能形成內生孢子。在釀造黃酒過程中，發酵環節由于原料的植物細胞壁及細胞間質的果膠中含有甲醇酯，在曲霉的作用下放出甲氧基而生成甲醇，醇類是黃酒的主要風味來源之一[31],因此在黃酒中甲醇的存在促進了以甲醇為營養物質的甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)的生長。曾有文獻報道，甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)可用于生產氨基酸[32]，但對其用于產凝乳酶在此之前尚未見報道，因此研究甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)用于生產凝乳酶，豐富了凝乳酶產生菌的資源庫。在后續試驗中可對其培養基和培養條件進一步優化，以提高其發酵液的凝乳活力，降低蛋白水解活力。

（3）本研究利用梯度稀釋法和劃線純化法初篩，酪蛋白平板法和液態培養基發酵法復篩后，分離篩選出了兩株產凝乳酶的優良細菌菌株，通過形態觀察，鏡檢，生理生化實驗并結合分子生物學，最終將這兩株菌分別鑒定為甲醇芽孢桿菌(B.methanolicus)LB-1和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)LB-2。生長曲線和凝乳活性曲線的研究結果表明，LB-1菌株生長穩定期較長，且在菌株生長穩定初期其發酵液凝乳活力達到最大值（269.66±0.78）SU/mL，此時的蛋白水解活力為（1.476±0.49）U/mL，其C/P為187.50；LB-2菌株生長穩定期較短，也在其穩定期時其發酵液的凝乳活力達到最大值（187.50±1.4）SU/mL，此時的蛋白水解活力為（1.29±1.41）U/mL，其C/P為145.34。兩株菌的發酵液形成的凝塊與商品凝乳酶形成的凝塊相比其質地和風味均無明顯差異，且無異味存在，可以作為發酵生產適于干酪加工的凝乳酶的候選菌株。

[1]李亮,吳丹,宿玲恰,等.重組畢赤酵母生產凝乳酶發酵優化[J].食品與生物技術學報,2016,35(5):457-464.DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2016.05.002

[2]KUMARI NARWAL R,BHUSHAN B,PAL A,et al.Purification,physico-chemico-kinetic characterization and thermal inactivation thermodynamics of milk clotting enzyme from Bacillus subtilis MTCC 10422[J].LWT-Food Science and Technology,2016,65:652-660.DOI:10.1016/j.lwt.2015.08.065

[3]AHMED S A,WEHAIDY H R,IBRAHIM O A,et al.Novel milk-clotting enzyme from Bacillus stearothermophilus as a coagu?lant in UF-white soft cheese[J].Biocatalysis&Agricultural Biotech?nology,2016,7:241-249.DOI:10.1016/j.bcab.2016.06.011

[4]趙愛梅,趙笑,段紫怡,等.酒曲發酵產凝乳酶及其酶學特性研究[J].中國乳品工業,2016,44(2):16-21.DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2016.02.004

[5]王洋怡舟,李柏林,歐杰,等.紹興黃酒酒曲總DNA的提取及其真菌多樣性[J].食品工業科技,2016,37(15).DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.026

[6]劉蕓雅,毛健,孟祥勇,等.紹興黃酒麥曲及發酵過程中細菌群落結構分析[J].中國食品學報,2017,17(1).

[7]任清,侯昌.北宗黃酒麥曲微生物的分離鑒定[J].食品科學,2017,38(4):77-82.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704013

[8]騰軍偉,余志堅,陳超,等.影響解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產凝乳酶的因素及發酵條件優化研究[J].中國食品添加劑,2016(8):53-62.DOI:10.3969/2j.issn.1006-2513.2016.08.002.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.05.093

[9]韓生義,趙淑琴,劉曉麗,等.一株堿性脂肪酶產生菌的篩選、鑒定及酶學性質研究[J].甘肅農業大學學報,2017,52(1):119-125.

[10]張衛兵.甘南牧區產凝乳酶細菌的篩選、產酶條件、酶學特性及應用研究[D].甘肅農業大學,2014.

[11]MILLER R J H,BARBARA C,DYLAN P,et al.Development and evaluation of a novel fast broad-range 16S ribosomal DNA PCR and sequencing assay for diagnosis of bacterial infective endocarditis:multi-year experience in a large Canadian healthcare zone and a liter?ature review:[J].BMC Infectious Diseases,2016,16(1):146.

[12]ALLMAN E S,RHODES J A,SULLIVANT S.Statistically Consis?tent k-mer Methods for Phylogenetic Tree Reconstruction[J].Jour?nal of Computational Biology,2017,10(6).DOI:10.1089/cmb.2015.0216

[13]YU J,TAMURA G,ARIMA K.Milk-clotting Enzyme from Micro?organisms[J].Agricultural&Biological Chemistry,1971,35(8):1194-1199.DOI:10.1080/00021369.1971.10860068

[14]薛璐,姜鐵民,任發政,等.江米酒凝乳機理的初步研究[J].食品與發 酵 工 業,2006,32(9):37-38.DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2006.09.009

[15]滕國新,全慶陽,王玉林,等.傳統清宮乳制品米酒奶(Guan-nai)的微生物學研究:北京食品學會成立二十周年學術論文集,1999[C].

[16]周靜,黃曉輝,肖冰梅,等.一株多功能芽孢桿菌的鑒定[J].中國微生態學雜志,2013,25(9):997-1000.DOI：10.13381/j.cnki.cjm.2013.09.001

[17]MORITA A,ARAKI T,IKEGAMI S,et al.Development of Tex?ture Evaluation Model Based on Viscoelastic Testing Methods for Cheddar Cheese[J].Japan Journal of Food Engineering,2016,16.

[18]楊述,高昕,許加超,等.不同硬度奶酪的質構及流變特性比較[J].食品科學,2010,31(21):50-53.

[19]王麗霞,王崧瑀,李雅玲.不同工藝參數對高水分Mozzarella干酪微觀結構及出品率的影響[J].中國食品添加劑,2017(3).

[20]馬艷麗,曹雁平,楊貞耐,等.SPME-GC-MS檢測不同中西方奶酪的揮發性風味物質及比較[J].食品科學,2013,34(20):103-107.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201320020

[21]KANG H R,HWANG H J,LEE J E,et al.Quantitative analysis of volatile flavor components in Korean alcoholic beverage and Japanese sake using SPME-GC/MS[J].Food Science&Biotechnology,2016,25(4):979-985.DOI:10.1007/s10068-016-0159-7

[22]BEZERRA T K A,ARAǘJO A R R,ARCANJO N M D O,et al.Optimization of the HS-SPME-GC/MS technique for the analysis of volatile compounds in caprine Coalho cheese using response sur?face methodology.[J].Food Science&Technology,2016,36(ahead).

[23]MFS C M T,JLL F,ALF P.Partial purification of new milk-clotting enzyme produced by Nocardiopsis sp.[J].Bioresource Technology,2004,93(1):29-35.DOI:10.1016/j.biortech.2003.10.003[24]NARWAL R K,BHUSHAN B,PAL A,et al.Optimization of Up?stream Process Parameters for Enhanced Production of Thermostable Milk Clotting Enzyme from Bacillus Subtilis MTCC 10422[J].Jour?nal of Food Process Engineering,2016.DOI:10.1111/jfpe.12356

[25]BENSMAIL S,MECHAKRA A,FAZOUANENAIMI F.Optimiza?tion of milk-clotting protease production by a local isolate of Asper?gillus niger FFB1 in solid-state fermentation.[J].Journal of Microbiol?ogy Biotechnology&Food Sciences,2017,4(5):467-472.

[26]張衛兵,梁琪,喬海軍,等.紫外線和硫酸二乙酯誘變高產凝乳酶地衣芽孢桿菌的研究[J].食品工業科技,2012,33(5):174-176.

[27]騰軍偉,趙笑,楊亞威,等.酒曲中產凝乳酶微生物菌株的分離篩選及鑒定[J].食品科學,2017:1-10.

[28]LI Y,GU Z,LIANG Z,et al.Inducible expression of trehalose syn?thase in Bacillus licheniformis[J].Protein Expression&Purification,2017,130:115-122.DOI:10.1016/j/pep.2016.10.005

[29]DUTT K,GUPTA P,SARAN S,et al.Production of Milk-Clot?ting Protease from Bacillus subtilis[J].Applied Biochemistry and Bio?technology,2009,158(3):761-772.DOI:10.1007/12010-008-8504-9

[30]ARFMAN N,DIJKHUIZEN L,KIRCHHOF G,et al.Bacillus methanolicus sp.nov.,a new species of thermotolerant,metha?nol-utilizing,endospore-forming bacteria.[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1992,42(3):439.DOI:10.1099/00207713-42-3-439

[31]張雨,冉宇舟,池國紅,等.米漿水對黃酒釀造和風味影響的研究[J].釀酒科技,2009,28(11):97-100.

[32]BRAUTASET T,JAKOBSENΦM,JOSEFSEN K D,et al.Bacillus methanolicus:a candidate for industrial production of amino acids from methanol at 50 degrees C[J].Applied Microbiology and Bio?technology,2007,74(1):22.DOI:10.1007/s00253-006-0757-z

Isolation and identification of rennet-producing strains from wheat Qu of Chi?nese rice wine

LI Liu1,ZHENG Zhe1,ZHAO Xiao1,CAO Yongqiang2,YU Zhijian2,CHEN Chao2,YANG Zhennai1,2
(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology&Business University（BTBU），Beijing 100048，China；2.Dongjun Dairy（Yucheng）Co.，Ltd，Yucheng 251200,China）

In this study,the microbes in the rice wine“wheat Qu”were screened by gradient dilution method and scribing method,fol?lowed by casein plate method and liquid culture medium fermentation.Two excellent bacterial strains of LB-1 and LB-2 producing rennet were obtained,which were further identified as Bacillus methanolicus and Bacillus subtilis by morphological observation,physiological and bio?chemical experiments and 16S rDNA sequence analysis.According to the enzyme activity curve,the highest milk clotting activity of the en?zymes from the two strains were 269.66±0.78 SU/mL and 187.50±1.4 SU/mL at 24 h fermentation,while the proteolytic activity were 1.476±0.49 U/mL and 1.29±1.41 U/mL,respectively.The ratio of milk clotting activity and proteolytic activity(C/P)were 187.50 and 145.34,respectively.Through the curd effect evaluation,the organization structure,texture parameters and flavor substances of the clots formed by the fermentation broth of the strains LB-1 and LB-2 had comparable milk-clotting effect with that of a commercial rennet,and they were suitable for cheese processing.

rice wine wheat Qu;rennet;isolation;identification;curd effect evaluation

Q93-331

A

1001-2230（2017）11-0004-07

2017-06-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（31601488）。

李柳（1993-），女，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術。

楊貞耐