乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的同時測定

黃曉林，宋戈，張麗宏，梁杰

（東北農業大學國家乳制品質量監督檢驗中心，哈爾濱 150028）

乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的同時測定

黃曉林，宋戈，張麗宏，梁杰

（東北農業大學國家乳制品質量監督檢驗中心，哈爾濱 150028）

建立了高效液相色譜同時分離測定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7種糖的方法。通過調節樣品溶液的pH值到1.7和4.5除去樣品中蛋白質，采用氨基色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，用蒸發光散射檢測器檢測。7種糖質量濃度在0.01～10.0 mg/mL內具有良好的線性關系，回收率在95.0%～104.1%，精密度(RSD)為1.98%～4.56%，檢出限在0.04～0.17 mg/g。該方法可用于乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的日常檢測。

單糖；雙糖；低聚果糖；乳制品；高效液相色譜；蒸發光散射

0 引言

乳糖是奶粉中含量較高的一種糖，可以促進鈣離子的吸收和有益菌的成長；低聚果糖具有改善腸道功能，增強免疫功能，促進鈣鎂鐵等礦物元素吸收和抗突變性等多種功效；果糖、葡萄糖、蔗糖也是常用的食品添加劑。糖使用都有相關的限量標準和檢測標準[1-4]，目前文獻報道糖含量的檢測方法主要包括示差折光檢測法[5-7]、電化學檢測法[8-12]、質譜法[13]和蒸發光散射檢測法[14-18]等，但有的靈敏度較低，有的準確度和重復性較差，有的不適用于乳制品檢測。

本方法針對乳制品，通過調節樣品溶液的pH值除去樣品中蛋白質，采用氨基色譜柱分離，用蒸發光散射檢測器檢測，同測定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，靈敏度高，準確，簡單實用。

1 實驗

1.1 儀器設備

Waters2695高效液相色譜儀，Alltech2000蒸發光散射檢測器,2300TH型超聲波振蕩儀。

1.2 材料試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標準溶液(1.000 mg/mL)；乙腈(色譜純)；實驗用水均為蒸餾水；亞鐵氰化鉀水溶液質量濃度為109 g/L；乙酸鋅水溶液質量濃度為219 g/L；鹽酸溶液濃度為1.0 mol/L，氫氧化鈉溶液濃度為1.0 mol/L；以上試劑除標注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shodex NH2P-50色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；檢測器：蒸發光散射檢測器；漂移管溫度為90℃；氣流量為2.2 L/min；流動相A為水；流動相B為乙腈；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0→15 min,10%A線性升至30%A；15→30 min,30%A；30→35 min,30%A勻速降至10%A,保持5 min。

1.3.2 樣品處理

乳粉：準確稱量3～4 g到三角瓶中，用50℃以下的水25 mL超聲溶解；液奶和酸奶：準確稱量10～20 g到三角瓶中,加入10 mL水搖勻。然后用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節樣品溶液的pH值到1.7后，放置一分鐘后再調節樣品溶液的pH值到4.5，用水轉移到50 mL容量瓶中定容搖勻，濾紙過濾后用0.45 μm濾膜過濾,供分析測定果糖、葡萄糖和低聚果糖，取濾膜過濾濾液稀釋10倍供分析測定蔗糖、乳糖。

1.3.3 定量測定

標樣、配方乳粉樣品和酸奶樣品測定的色譜圖如圖1所示。圖1中，峰1～峰7分別為1果糖，2葡萄糖，3蔗糖，4乳糖，5蔗果三糖，6蔗果四糖，7蔗果五糖。

圖1 7種目標物混合標準溶液、配方乳粉樣品和酸奶樣品色譜

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

關于糖類檢測，國家檢測標準[3-4]推薦的色譜柱是NH2柱，流動相為乙腈與水，比例為70∶30。通過改變乙腈與水的比例發現各種糖的保留時間會發生顯著變化，并且隨著水的比例的增加而保留時間不斷縮短。經過優化通過改變乙腈與水的比例，當以乙腈與水的比例為75∶25等度洗脫時，發現果糖葡萄糖二者保留時間接近，無法完全分離。當乙腈與水比例為以80∶20等度洗脫時，這兩種物質分離度有所改善。當乙腈與水比例從80∶20漸變到90∶10，發現二者分離效果較好，但蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖這三種低聚果糖保留時間過長，導致響應小，靈敏度低，而乙腈與水比例為70∶30時，這三種低聚果糖保留時間適當，靈敏度惡較高。通過嘗試乙腈與水比例從90∶10漸變到70∶30，果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖被洗脫出來，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖這三種低聚果糖在色譜柱柱前富集，再維持乙腈與水比例70∶30一段時間，加快低聚果糖的洗脫，保證了低聚果糖峰形不拖尾和較高的響應，縮短整體的分離時間。所以在保證各組分良好分離的前提下，加快了乙腈上升的速率，縮短了分析時間，提高了靈敏度，最終的梯度程序為1.3.1節所述。

2.2 檢測器參數的確定

載氣流速和漂移管溫度是蒸發光散射檢測器中可以調節的兩個重要參數，建立HPLC-ELSD分析方法需要對這兩個參數進行優化。由于蔗果五糖靈敏度較低，出峰時間較晚，所以選擇蔗果五糖為代表確定蒸發光散射檢測器的參數。在相同的載氣流速下，漂移管溫度從60℃增加，流動相逐漸得到充分揮發，噪聲不斷降低，而蔗果五糖的響應不斷增加，當漂移管溫度的溫度為90℃時信噪比最高，漂移管溫度的溫度進一步增加，噪聲大小基本維持不變，而蔗果五糖的響應開始大幅度降低，信噪比就降低了如圖2（a），所以漂移管溫度確定為90℃。在其它條件不變的情況下，載氣流速越小，形成的物質粒子半徑越大，對激光的散射能力越強，相應的響應信號越大。但并不是載氣流速越小越好，因為當載氣流速太小時，流動相不能完全揮發，背景噪聲會增加，信噪比也會降低。最優載氣流速應是在可接受噪音的基礎上，產生最大檢測響應值時的最低流速。在相同的漂移管溫度下，載氣流速從1.5 L/min增加，流動相逐漸得到充分揮發，噪聲不斷降低，而蔗果五糖的響應不斷增加，當載氣流速為2.2 L/min時信噪比達到最高，載氣流速進一步增加，噪聲略有降低，而蔗果五糖的響應開始大幅度下降，信噪比就變小了如圖2（b），所以載氣流速確定為2.2 L/min。

2.3 樣品提取條件的確定

圖2 OPO信噪比與檢測器參數的關系

由于乳制品中含有較多的蛋白質和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，不利于提取分離。由于糖易溶于水，用乙腈或乙醇等有機試劑沉淀，加入的量少，沉淀效果不好，加入的量多，會有部分糖析出，都會給出的結果帶來影響。加堿或硫酸銅沉淀蛋白，會導致糖類化合物發生化學變化，影響測定結果的準確性。選擇國家檢測標準[3-4]使用的亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復合沉淀劑，可除去樣品中絕大部分蛋白質和脂肪，效果要比加乙腈或乙醇等有機試劑沉淀、加堿或硫酸銅沉淀等其他方法好。但如果亞鐵氰化鉀和乙酸鋅復合沉淀劑加入的少，蛋白沉淀不完全，會給提取和凈化帶來困難，影響測定，加的過多會造成提取不完全導致被測物的損失，復合沉淀劑的濃度和用量不好控制，此外對色譜柱傷害大，影響色譜柱使用壽命。通過試驗，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調節樣品溶液的pH值到1.7后，再調節樣品溶液的pH值到4.5，沉淀蛋白效果好，糖類不易析出，提取效果好，沒有外加入大量的鹽有利于蒸發光散射檢測器檢測，回收率較好，準確度較高。

2.4 標準曲線和檢出限

散射光的響應值與粒子質量的關系為I＝kmb，m表示待測組分的粒子質量和，I表示待測組分所產生的散射光光強，k,b為常數。通過使用雙對數方法產生線性曲線,即對待測組分的濃度和響應同時取對數,得到線性方程lgI＝blgm＋lgk。分別配制不同濃度的標準混合溶液，在最佳色譜條件下，進行了標準曲線的測定，得到7種糖的回歸方程及線性相關系數、線性范圍，并以3倍信噪比時的進樣濃度計算出了方法的檢出限如表1所示。

2.5 回收率

以同一個配方奶粉樣品為實驗材料，加入一定量的合成色素標準混合溶液,進行加標實驗，平行測定3次，以平均測定值計算回收率，結果如表2所示。

2.6 方法的精密度

以同一個配方奶粉樣品為實驗材料，稱取樣品后加入5 mg/mL的7種糖標準混合溶液1.0 mL，進行平行8次重復性實驗,計算測定值的相對標準偏差(RSD)。這7種糖的RSD在 1.98%～4.56%。由此可以看出，測定結果的較為穩定，方法的重復性較好。

表1 7種糖的標準曲線、相關系數以及線性范圍和檢出限

表2 7種糖的回收率（n=3）

3 結論

本文重點研究了樣品的提取條件、色譜分離條件和檢測參數的設定，建立了高效液相色譜-蒸發光散射檢測同時測定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7種糖的方法。該方法測定結果重現性好，準確度高，簡單易操作，適合乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的日常檢測。

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[2]GB 14880-2012食品安全國家標準食品營養強化劑標準[S].

[3]GB 5009.8-2016食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的測定[S].

[4]GB 5009.225-2016食品安全國家標準食品中果聚糖的測定[S].

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Simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccha?rides in dairy products

HUANG Xiaolin,SONG Ge,ZHANG Lihong,LIANG Jie
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A method for simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccharides(fructose,glucose,sucrose,lactose,1-kestose,nystose,1F-Fructofuranosyl nystose)in dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was established.Protein in dairy products were mostly eliminated by adjusted pH to 1.7 and 4.5,separated on NH2column with a mixed solution of acetonitrile-water as mobile phase by gradient elution,and detected with an evaporative light-scattering detector(ELSD).All the seven sugars had good linearities with 0.01～10.0 mg/mL.The recovery were 95.0%～104.1%,the relative standard deviations(RSD)were 1.98%～4.56%,the minimum detect?able values were 0.04～0.17 mg/g.The method can be used for the routine analysis of these sugars in dairy products.

monosaccharides;disaccharides;oligosaccharides;dairy products;HPLC;ELSD

TS252.7

A

1001-2230（2017）11-0037-03

2017-03-29

黃曉林（1982-），女，工程師，從事乳制品檢測與研究。