牦牛酸奶和酥油中乳酸菌的分離和鑒定

羅毅皓，孫萬成

（青海大學農牧學院動物科學系,西寧 810016）

牦牛酸奶和酥油中乳酸菌的分離和鑒定

羅毅皓，孫萬成

（青海大學農牧學院動物科學系,西寧 810016）

利用生化鑒定試劑盒，從青海不同地區牦牛酸奶樣品以及酥油樣品中分離出的乳酸菌種。分別為為嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、菌種為干酪乳桿菌干酪亞種或鼠李糖乳桿菌。采用MiSeq測序的方法測定微生物的組成結構及其分布，結果表明，大通樣品中含有細菌種類5個，剛察樣品中4個，共和樣品中含有5個，玉樹樣品中含有4個。牦牛酸奶樣品中主要優勢菌為乳酸桿菌和鏈球菌，主要包括乳酸桿菌（Lactobacillus）和鏈球菌種（Streptococcus）。通過主成分分析得知大通與剛察的乳酸菌菌株遺傳親緣關系較近，玉樹及共和的酸奶的乳酸菌菌株遺傳親緣關系最遠。

牦牛酸奶，牦牛酥油，乳酸菌，鑒定

0 引言

牦牛乳與普通牛乳相比，含有豐富的蛋白質、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質，因此具有極高的營養價值[1]。牧民沿用傳統而古老的方法加工牦牛酸奶和牦牛酥油等乳制品，能較好地保存了當地自然環境中的有益微生物(特別是乳酸菌)[2]。通過分離出牦牛酸奶和酥油中的乳酸菌，對其菌種進行鑒定，分析其多樣性，將為牦牛酸奶和酥油產品的商品開發提供基礎研究[3-5]。

MiSeq測序的方法有效地避免了通量低、操作復雜和準確率低等缺陷[6-9]，它具有操作簡單、成本較低的優勢，并且采用邊合成邊測序原理，結果可信度高[10]。因此，利用MiSeq測序法可以更加快速、準確地分析牦牛酸奶中的乳酸菌多樣性。

1 實驗

1.1 材料

樣本采集：樣品分別采自青海大通，共和，剛察，玉樹4個地區5個牧場牧民家庭自制傳統發酵的牦牛酸奶樣品和1個牦牛酥油樣品。

材料：乳酸桿菌瓊脂培養基、MRS肉湯、肉湯（LB Broth Medium），生化鑒定管。

儀器：PCR儀（ABI GeneAmp?9700型），Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺，QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統。

1.2 方法

1.2.1 菌種純化

根據菌落形態特征挑選菌落，用乳酸桿菌瓊脂培養基劃線分離至純菌株，將革蘭氏染色陽性，顯微鏡下觀察呈桿狀的菌株初步選為乳酸桿菌。

1.2.2 生化鑒定

將分離出的菌種分別進行七葉苷，纖維二塘，麥芽糖，甘露醇，水楊苷，山梨醇，蔗糖，棉籽糖的發酵試管中，置37℃恒溫箱中培養24 h。

1.3 MiSeq測序

1.3.1 基因組DNA抽提

完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增

每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.3 熒光定量

參照電泳初步定量結果，將PCR產物用Quanti?FluorTM-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.3.4 Miseq文庫構建

（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

1.3.5 Miseq測序

（1）DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；（2）另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋 (bridge)”；（3）PCR 擴增，產生DNA簇；（4）DNA擴增子線性化成為單鏈。（5）加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成一個堿基；（6）用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類；（7）將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端黏性，繼續聚合第二個核苷酸；（8）統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.6 數據分析

對原始數據進行質量控制，舍棄低質量序列（質量值20以下的堿基）。用軟件Flash連接通過質量控制的序列對應的兩端序列進行。設計無法連接的序列。對連接上的序列進行過濾，獲得最終用于分析的序列。對OTU列表中獲得的分類信息與豐度進行整理，分別在科屬種層次下對各樣品進行Heatmap、群落結構組成,多樣本相似度分析及PCA分析。

2 結果與討論

2.1 生化鑒定

生化鑒定管在37℃下培養24 h以后結果如表1所示。

由表1可以看出，2個共和樣品和玉樹樣品中的菌種為嗜酸乳桿菌，大通樣品中的菌種為羅伊氏乳桿菌，剛察樣品中的菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種，酥油中的樣品菌種為干酪乳桿菌干酪亞種或鼠李糖乳桿菌。

2.2 MiSeq測序

大通，剛察，共和，玉樹4個樣品分別讀取了16623,17641,21095,17984條有效序列。

2.2.1 樣品所含操作分類單元及所含序列的數目

如圖1所示，大通樣品中含有乳酸菌種類5個，剛察樣品中4個，共和樣品中含有5個，玉樹樣品中含有4個。大通和剛察有相同種類4個，大通和剛共和有相同種類5個，大通和玉樹有相同種類4個，剛察和共和有相同種類4個，大通和玉樹有相同種類4個，共和和玉樹有相同種類4個。大通剛察和共和有相同種類4個，大通、剛察和玉樹有相同種類4個，大通、共和和玉樹有相同種類4個，剛察、共和和玉樹有相同種類4個，在相似度0.97基礎上分類出5門，62702綱，3700目，196科，27屬。

圖1 操作分類單元文氏圖

2.2.2 酸奶中群落組成分析

根據分類學分析結果，可以得知一個或多個樣本在各分類水平上的分類學比對情況[13]。如圖2所示，樣品所含物種基本相似，但物種分布差異較大，對所含主要種進行了分析和歸類。主要物種包括2類，未分類乳酸桿菌種（Lactobacillus_unclassified）、唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus_salivarius_subsp._thermophilus）。樣品中乳酸桿菌種含量最多，玉樹樣品與其他樣品的不同在于玉樹樣品中唾液鏈球菌嗜熱亞種較多，而其他3個地方牦牛乳樣品都是乳酸桿菌種占絕大多數，有少量唾液鏈球菌嗜熱亞種和極少量其他種菌類。

2.2.3 聚類分析

分別在科屬種的水平上利用Heatmap圖分析了菌群的相似性和多樣性，牦牛酸奶菌落分為5個大的分支，其中最為優勢的OTU單元為未分類的乳酸桿菌（Lactobacillus）；其中共和樣品中未分類的乳酸桿菌（Lactobacillus_unclassified）包含序列數最多，含19 548條序列。由圖3可知，在大通和剛察樣品中未分類的乳酸桿菌（Lactobacillus_unclassified）包含序列也較多。

表1 發酵管生化鑒定

圖2 酸奶樣品物種分布圖（種）

圖3 系統發育進化樹（種）

2.2.4 PCA分析

PCA分析[14](Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一種對數據進行簡化分析的技術，利用各樣品序列間的進化信息計算樣品距離，觀察4種不同酸奶樣品多樣性差異。由圖4可知，PCA分析中大通與剛察的乳酸菌種遺傳親緣關系距離較近，玉樹及共和的酸奶的乳酸菌遺傳親緣關系距離最遠。表明酸奶樣品群落存在一定的差異性，因此，地域分布差異對各個群落組成有很大影響。

2.2.5 多樣本相似度樹狀圖

圖4 酸奶樣品群落主坐標分析

利用樹枝結構描述和比較多個樣本間的相似性和差異關系。首先使用描述群落組成關系和結構的算法計算樣本間的距離，即根據beta多樣性距離矩陣進行層次聚（Hierarchical cluatering）分析[14]，使用非加權組平均法UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法構建樹狀結構，得到樹狀關系形式用于可視化分析。

利用各樣品序列間的進化信息計算樣品距離，觀察4種不同酸奶樣品多樣性差異。由圖可知，Hierar?chical cluatering分析中大通與剛察的乳酸菌距離較近，共和的酸奶的乳酸菌距離較遠，玉樹樣品的乳酸菌距離最遠。表明4個酸奶樣品群落存在一定的差異性，因此，地域對各個群落組成有重要影響。

圖5 相似度樹狀圖

3 結論

（1）用乳酸桿菌瓊脂培養基從青海各地區牧民酸奶中分離出乳酸菌，經過生化鑒定發酵管試驗得出2個共和樣品和玉樹樣品中的菌種為嗜酸乳桿菌，大通樣品中的菌種為羅伊氏乳桿菌，剛察樣品中的菌種為德氏乳桿菌保加利亞亞種，酥油中的樣品菌種為干酪乳桿菌干酪亞種或鼠李糖乳桿菌。

（2）采用MiSeq測序的方法，直接從環境樣品中擴增高變區進行測序，避免了不可培養菌株的不可測性，客觀還原菌群結構及豐度比例，牦牛酸奶樣品在相似度0.97基礎上分類出細菌5門，62702綱，3700目，196科，27屬。主要包括乳酸桿菌（Lactobacillus）和鏈球菌種（Streptococcus）。

（3）通過菌落組成分析，4個樣品的主要優勢菌為乳酸桿菌，所占比例均超過了50%，另外一種優勢菌是鏈球菌。

（4）由PCA分析和Hierarchical cluatering分析可以看出4個樣品菌群分布存在一定差異性，說明地域對其微生物組成影響較大。

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Separtarion and identification of Lactobacilli in yak yogurt and yak butter

LUO Yihao，SUN Wancheng
(Department of Animal Science,College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai 810016,China)

These were the research on the biological characteristics of Yak Yogurt samples and on of Yak butter sample from different areas in Qinghai.The results showed that three of six samples strain of Lactobacillus acidophilus,one the samples for Lactobacillus reuteri,one sample be?longs to Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and one sample can be Lactobacillus casei or Lactobacillus rhamnosus.Also,the microbial composi?tion structure and its distribution of the four samples can be measured by MiSeq sequencing method.The results showed that the samples from Datong,Gangcha,Gonghe and Yunshu contain five bacterial species,four species,five species and four species,respectively.The domi?nant bacteria from those samples is Lactobacillus and Streptococcus,which represents mainly including Lactobacillus and Streptococcus.Through prin?cipal component analysis,we found the Lactic acid bacteria from Datong sample and Gangcha sample was similar to each other while Yushu sample and Gonghe sample were quite different from other samples.

Yak yogurt；Yak butter；Lactobacillus；identification

Q93-331

A

1001-2230（2017）11-0011-03

2016-12-10

羅毅皓(1976-)，女，副教授，研究方向為食品生物技術。

孫萬成