熱處理對牛乳蛋白質消化率的影響

劉曉，姜竹茂，蘆晶，張書文，劉鷺，逄曉陽，呂加平

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005）

熱處理對牛乳蛋白質消化率的影響

劉曉1，2，姜竹茂2，蘆晶1，張書文1，劉鷺1，逄曉陽1，呂加平1

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005）

采用體外模擬胃腸道消化的方法研究了不同熱處理對牛乳蛋白消化的影響，通過聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜（HPLC）和尺寸排阻高效液相色譜等方法對各個成分進行檢測。結果表明：隨著熱處理溫度的升高，蛋白消化能力逐步降低；鮮牛乳中蛋白質被消化為游離氨基酸及小肽的程度較加熱乳制品高；乳中蛋白質經消化主要生成分子量低于1500 u的肽段，易于人體消化吸收。

熱處理；消化率；體外模擬；肽段；氨基酸

0 引言

牛乳營養豐富，含有人體所需的氨基酸、礦物質、維生素及優質蛋白，一直認為是人類膳食中最接近完美的食品之一[1]。熱處理是乳品加工的一個不可或缺的關鍵環節，一方面加熱可以殺死牛乳中的致病菌，保障牛乳的貨架期，同時還可以獲得獨特的風味物質[2]；另一方面，熱處理也會對牛乳品質產生負面影響，例如會導致牛乳營養成分損失，蛋白質變性等[3]。乳中各個成分中，乳蛋白對熱較為敏感，加熱處理可能會造成乳蛋白性質變化、或者與乳中碳水化合物、鹽類等共同發生變化[4-5]，直接影響了牛乳營養及功能特性[6]。由于蛋白質在牛奶營養成分中的重要性及對熱的敏感性，熱處理對牛奶蛋白質品質的影響已經引起很多研究人員的重視，并取得了重要的進展，對指導乳品加工及保證產品品質具有重要意義。

本文主要以牛乳蛋白質為研究對象，通過體外模擬蛋白消化，采用組學等技術對消化后牛乳蛋白成分、蛋白消化率、功能肽段等進行研究，從而揭示熱處理對牛乳蛋白消化的影響規律，為今后相關研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

鮮牛乳（市售），α-淀粉酶，溶菌酶，黏蛋白，牛血清蛋白，胃蛋白酶，胰液素，膽鹽，氯化鈣，磷酸二氫鈉，丙烯酰胺，過硫酸銨（均為分析純），四甲基乙二胺，考馬斯亮藍R250，蛋白質Marker等。

1.2 儀器與設備

UV-2300型紫外可見分光光度計；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱；脫色搖床TS-1；漩渦混合器MVS-1；SC-15數控超級恒溫槽；3K-15離心機；DELTA 320 pH計；BSA 124S-CW分析天平；EPS301電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備：新鮮牛乳分別進行巴氏殺菌和超高溫瞬時滅菌（UHT）。其中巴氏殺菌的條件是85℃，10 s；UHT滅菌的條件是135℃，5 s。乳粉是鮮牛乳進行巴氏殺菌后進行噴霧干燥，進口溫度為180℃，出口溫度為80℃。

1.3.2 體外模擬消化[7]

蛋白質的消化主要分為胃液消化和腸液消化。胃液中的胃蛋白酶和腸液中的胰蛋白酶都為內切酶，其中胃液中的胃蛋白酶主要作用部位為芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵；而腸液中的胰蛋白酶主要作用在碳端連接賴氨酸和精氨酸殘基的肽鍵。食物進入胃之后，胃蛋白酶會將食物中的蛋白質分解成肽段，然后受小腸中由胰腺分泌的胰蛋白酶的作用，分解成大量的小分子肽段和少量的游離氨基酸，其中肽主要由2～6個氨基酸殘基組成。

（1）消化液的配制

體外消化液根據文獻[8]中方法，消化液的質量濃度從文獻中得出[9]，分別配制唾液消化液、胃液、胰液、和膽汁4種消化液（配制方法如表1）。

（2）胃液消化

①取熱處理牛乳樣品2.25 mL，加入唾液消化液3 mL，37 ℃保溫5 min。

②然后取6 mL的胃液加入上述唾液消化樣品中，37℃振搖120 min。

（3）腸液消化

向胃消化后的樣品同時加入6 mL的胰液和3 mL的膽汁，37℃振搖120 min。消化后的樣品要盡快放入-80℃的冰箱凍存，以防樣品變質，影響實驗結果。

1.3.3 凝膠電泳[10-11]

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）按照蛋白質分子量的大小進行蛋白分離。樣品取自鮮牛乳和熱處理樣品，以及在胃消化和腸消化后的各個樣品，進行電泳，分離大于5 ku的蛋白。使用分離膠的質量分數為12%。電泳所用marker分子量范圍在14.4～94 ku之間。測定樣品的蛋白含量，將樣品稀釋，最終確定所有的樣品蛋白含量相同，與上樣緩沖液等量混合，沸水浴3～5 min，離心2 min，取10 μL樣品進行上樣，電泳結束后，凝膠使用考馬斯亮藍染色液進行染色。

1.3.4 蛋白消化率的測定

牛乳經過凝膠電泳后，計算每種蛋白的灰度值，根據下列公式進行計算，即

蛋白消化率/%=（原樣中蛋白灰度值-消化后蛋白灰度值）/原樣蛋白灰度值×100

1.3.5 游離氨基酸及短肽的測定[12-13]

蛋白質和較長的肽段用濃度為0.5 mol/L的高氯酸沉淀。和在巰基乙醇酸中的鄰苯二甲醛（OPA）反應后的上清液中的氨基酸和肽段在340 nm下測定。具體如下：

① 25 μL樣品和25 μL高氯酸（5 mol/L）混合，用75 μL水稀釋，在4℃下保溫15 min。

②離心，取30 μL上清液與反應溶液（0.05 mol/L硼酸鹽，10 g/L十二烷基硫酸鹽，0.8 g/L OPA，5 g/L嗎啉乙磺酸鈉鹽Na-MES和質量濃度為5 g/L的Tri?ton X-100混合比例為1∶30）在室溫下黑暗培育40 min，在340 nm下測定吸光度。

表1 模擬消化液組分

1.3.6 游離氨基酸成分的測定（HPLC）[14]

取25 μL樣品，加入200 μL乙腈沉淀蛋白，轉速為7 000 r/min，離心1 min，移取上清液，55℃真空干燥。樣品干燥后，用25 μL超純水復溶。吸取10 μL復溶樣品進行衍生化處理，用液相進樣針吸取25 μL衍生化樣品進行色譜分離及測定。色譜條件如下：Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動相A按照1∶10將AccQ·TagA濃液用水稀釋；流動相B為乙腈/水（60/40）；流速 1.0 mL/min，柱溫 37 ℃；波長為248 nm。

1.3.7 肽段長度分布的檢測[15]

消化的樣品用濾管離心過濾，10 000 g/min，離心30 min，取濾液，用尺寸排阻色譜柱分離，并進行分析，其中色譜標準品的分子量的選擇要包含所有樣品肽段的分子量。BioBasic SEC-300色譜柱（7.8 mm×150 mm）；緩沖液A∶50%水∶50%乙腈∶0.1%甲酸；流速為0.5 mL/min，在214 nm下色譜分離并檢測。

表2 不同熱處理乳蛋白的胃液消化率

2 結果與分析

2.1 熱處理對牛乳蛋白消化程度的影響

牛乳中蛋白質的主要成分有酪蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白）和乳清蛋白（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）。由圖1可見，隨著熱處理溫度的升高，消化液蛋白條帶的色度逐漸降低，蛋白質的含量在不斷減少。經過胃液消化后，蛋白質含量明顯減少，但不能完全被消化，其中鮮牛乳的蛋白消化最為顯著。牛乳經過腸液消化后基本消化完全，蛋白消化率達到90%以上。其中以β-乳球蛋白為例，發現β-乳球蛋白在經過胃液消化后變化不明顯，而經過腸液消化后消化完全。其中，以表2可知，胃液消化過程中，不同熱處理條件下，各種蛋白成分的消化率都存在很大差異，而表3中，腸液消化過程中，各種蛋白成分消化率差異很小，說明各個蛋白組分基本消化完全。所以樣品經過胃液消化和腸液消化后，蛋白質基本消化完全，其中鮮牛乳的蛋白消化率最高。

表3 不同熱處理乳蛋白的腸液消化率

圖1 熱處理樣品蛋白消化液SDS-PAGE

圖1中，0代表marker；A-1，B-1，C-1分別代表鮮牛乳樣品；A-2，B-2，C-2分別代表巴氏殺菌乳樣品；A-3，B-3，C-3代表UHT乳樣品；A-4，B-4，C-4代表乳粉樣品。

2.2 熱處理對游離氨基酸及短肽質量分數的影響

蛋白質是由不同的氨基酸以肽鍵連接，按一定序列、比例、排列方式組成，在維持機體的組織結構、生長、新陳代謝、實現各種生理功能等方面發揮著重要作用[16-17]。由于游離氨基酸是人體可直接吸收的營養成分，它的質量分數和成分能夠部分地反映出牛乳的營養價值。研究熱處理對氨基酸消化吸收的影響，是非常有意義的。

通過OPA法檢測消化樣品游離氨基酸及短肽（＜4個氨基酸）質量分數，腸液消化后氨基酸及短肽質量分數高于胃消化后的氨基酸質量分數。在胃液消化后，隨著熱處理溫度的升高，氨基酸及短肽的質量分數呈現下降趨勢，這有可能是由于溫度升高，一方面部分蛋白變性，致使氨基酸及短肽含量減少，另一方面蛋白質與糖發生美拉德反應，使可被胃蛋白酶消化的氨基酸含量減少[18，19]。但是在腸液消化過程中，隨著熱處理溫度的升高，氨基酸及短肽含量不斷增多，造成這一現象是經過熱處理后的牛乳蛋白變性，其構象發生改變，結構展開，蛋白酶的內切位點增多，對胰蛋白酶更加敏感，由于蛋白酶的作用，牛乳中的蛋白質消化完全，更宜于分解成游離的氨基酸及小分子肽類[20-21]。

由圖3和圖4可以看出，樣品經過腸液消化后，由于胰蛋白酶和膽汁的消化作用，大分子蛋白質及其肽段分解成氨基酸，致使氨基酸各個成分的質量分數明顯增多，也說明蛋白質消化主要是腸液消化過程。根據圖3，隨著熱處理溫度的不同，氨基酸各個成分質量分數發生很大變化。胃液消化后，賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和亮氨酸的質量分數隨熱處理溫度的升高而顯著降低；而組氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量則顯著上升[22-23]，其中乳粉中組氨酸的質量分數最高。圖4為熱處理樣品腸液消化后的氨基酸質量分數。圖4中，鮮牛乳中除了組氨酸、精氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸含量在4種樣品中較低外，其他氨基酸的質量分數在4種樣品中含量最高。4種樣品經胃腸液模擬消化后，鮮牛乳生成游離氨基酸的質量分數顯著高于其他3種乳制品，說明鮮牛乳蛋白質完全消化水平較其他樣品高。

圖2 消化樣品游離氨基酸及小肽的含量

圖3 胃液消化樣品氨基酸質量分數

圖4 腸液消化樣品氨基酸質量分數

2.4 蛋白質體外消化后肽段分布情況

本文利用蛋白純化系統分析乳蛋白經體外消化后肽段的分布情況，結果如圖5和圖6所示。

由圖可見，消化樣品肽段分子量主要是在1 500 u以內，主要在300～1 500 u之間，即由大約2～12個氨基酸組成，有研究表明，成年的動物腸液消化吸收的肽段長度從3肽到51肽[24]，這說明乳中蛋白質被消化為可吸收利用的肽段及氨基酸比例很高，4種樣品＜1 500 u的肽段含量均超過90%。如圖6所示，乳中蛋白質經腸液進一步消化，300～1 500 u的肽段含量有所降低，但仍為主要消化產物，小于300u的肽段含量逐漸增高。

3 結論

本文通過體外模擬消化的方法，研究熱處理對蛋白消化的影響規律。結果表明：

圖5 不同熱處理樣品胃消化后肽段分子量

圖6 不同熱處理樣品腸消化后肽段分子量分布

（1）在胃液消化過程中，蛋白消化不完全，在小腸內進一步消化為小分子量肽段及游離氨基酸。

（2）SDS-PAGE分析顯示，鮮牛乳中蛋白質的消化率較加熱乳制品中蛋白質消化率高

（3）通過測定消化后游離氨基酸含量發現，鮮牛乳中蛋白質被完全消化為游離氨基酸程度較加熱乳制品高。

（4）隨著樣品熱處理程度的增高，消化產物中氨基酸與小分子量肽段（＜4肽）的含量逐漸增高。

（5）乳中蛋白質經消化主要生成分子量低于1 500 u的肽段，易于人體消化吸收。

熱處理溫度的不同，對蛋白消化的影響也不同，選擇合適的熱處理方式對乳品工業非常重要。

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Effect of heat-treatment process on the digestibility of milk protein

LIU Xiao1,2，JIANG Zhumao2，LU Jing1，ZHANG Shuwen1，LIU Lu1，PANG Xiaoyang1，LYU Jiaping1
（1.Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijng 100193，China；2.College of Life Sciences，Yantai University，Shandong，Yantai 264005，China）

The effect of heat treatment on the digestion of milk protein was studied by in vitro digestion of gastrointestinal tract.The compo?nents were tested by polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE），high performance liquid chromatography（HPLC）and size exclusion high performance liquid chromatography（HPLC）.Research shows that with the increase of heat treatment temperature，the digestibility of protein was decreased，the amount of free amino acids and peptides released by protein in raw milk was higher than that in heated milk sam?ples.The proteins were mainly digested into peptides with the molecular weight lower than 1 500 u，which were easily absorbed by human.

heat treatment；digestibility；vitro gastrointestinal；peptide；amino acids

TS252.1

A

1001-2230（2017）11-0014-05

2017-03-07

國家自然科學基金（31671878）；國家自然科學基金（31401514）；國家科技支撐計劃（2013BAD18B10）；現代農業產業技術體系北京市奶牛產業創新團隊；公益性行業科研專項（201303085）。

劉曉（1990-），女，碩士，研究方向為乳品科學技術。

呂加平