ZAβ3和Aβ16–40親和作用的分子機理解析

劉夫鋒 范玉波 劉 珍 白 姝,*

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ZAβ3和Aβ16–40親和作用的分子機理解析

劉夫鋒1,2,3,4范玉波1劉 珍1白 姝1,*

(1天津大學化工學院生物工程系，天津 300072；2工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457；4天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

淀粉樣多肽(amyloid-β peptide, Aβ)聚集是引起阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)的主要原因。開發Aβ聚集抑制劑是治療AD的最有效手段之一。利用噬菌體展示技術篩選出來的ZAβ3蛋白質能夠有效抑制Aβ聚集，但ZAβ3和Aβ之間的作用區域和關鍵氨基酸殘基尚不清楚。針對此問題，本研究利用分子動力學模擬、MM-PBSA自由能計算和分解方法研究了ZAβ3-Aβ16–40復合物之間的相互作用機制。結果表明，ZAβ3的β-股和Aβ16–40之間的親和作用占主導，而ZAβ3的α-螺旋貢獻很小。利用分子力學-帕松波爾茨曼溶劑可及化表面積方法(MM-PBSA)自由能分解發現ZAβ3的熱點殘基為E15、I16、V17、Y18、L19、P20、N21和L22，而Aβ16–40的熱點殘基為F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。ZAβ3通過將發夾型Aβ單體包埋在α-螺旋圍成的疏水性腔體內來阻礙Aβ聚集。這種結合模式為設計高效的Aβ蛋白質類抑制劑提供了三個基本要素：高親和性的結合片段(β-股)、附屬結構(α-螺旋)和通過二硫鍵形成的穩定構象。高親和性結合片段能競爭性地與Aβ單體結合，附屬結構α-螺旋可以阻礙其它Aβ單體靠近，而穩定的構象是上述兩種要素發揮作用的基礎，三者協同作用可以有效地抑制Aβ聚集。

蛋白質抑制劑；淀粉質蛋白質；分子動力學模擬；自由能分解；親和機理

1 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種起病隱匿、進行性發展的神經系統退行性疾病。AD的初期臨床表現為記憶力衰退和認知能力下降，隨著病情的發展病人會出現執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆癥狀1?，F有研究表明β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β protein，Aβ)相互聚集形成的寡聚體和纖維具有毒性，能夠促發炎癥級聯反應、軸突損傷、突觸丟失和細胞凋亡等病理改變，是導致神經元變性乃至形成癡呆的重要因素2。早期研究認為Aβ聚集形成的淀粉斑或纖維具有神經毒性，而越來越多的證據表明可溶性Aβ寡聚體的神經毒性更大3,4。但無論是Aβ寡聚體還是成熟纖維，只要阻止Aβ的聚集就可從根本上消除Aβ所引發的神經毒性。

目前常見的能夠抑制Aβ錯誤折疊和聚集的抑制劑主要包括以下四類：小分子5,6、短肽7、納米粒子8和蛋白類抑制劑9。其中，具有較高親和性和生物相容性的蛋白質類抑制劑近年來成為Aβ聚集抑制劑的主要來源之一10。一些能夠與Aβ具有較高親和性的蛋白質被設計和篩選出來。例如，Hoyer等11利用噬菌體展示系統從組合蛋白庫中篩選出來一種來源于金黃色葡萄球菌的蛋白A的Z結構域(ZAβ3)。研究結果表明，ZAβ3與Aβ1–40單體的中間片段和C端結合，并且Aβ1–40單體以β發夾的結構存在于ZAβ3二聚體所圍成的管狀疏水腔內。ZAβ3二聚體和Aβ1–40單體之間的親和作用是其抑制Aβ1–40聚集的主要機理，但ZAβ3抑制Aβ1–40聚集的作用機制尚不清晰。

本研究擬利用分子動力學(MD)模擬、分子力學-帕松波爾茨曼溶劑可及化表面積方法(MM-PBSA)計算ZAβ3與Aβ16–40之間的結合自由能，然后利用自由能分解方法將這些結合自由能分解到每個氨基酸殘基上，確定ZAβ3親和結合Aβ16–40的關鍵作用區域、關鍵殘基和作用力類型。上述研究結果可以為理性設計多肽類或蛋白質類抑制劑提供切實可行的理論依據。

2 實驗部分

2.1 模擬體系

ZAβ3與Aβ16–40復合物的三維結構從蛋白質數據庫(Protein Data Bank，PDB)獲得，它的PDB ID為2OTK11。如圖1(a)所示，該模擬體系含有1個Aβ16–40和2個ZAβ3單體。為了便于描述兩個ZAβ3單體，將與Aβ16–40C端結合的ZAβ3單體命名為ZAβ31，而將與Aβ16–40N端結合的ZAβ3單體命名為ZAβ32。其中，Aβ16–40中的L17-D23和A30-V36為β-股結構，分別定義為β1和β2。模擬體系中ZAβ31和ZAβ32形成一個中心對稱的“Z”型結構域。ZAβ3的單體含有一個β-股和兩個α-螺旋。與Aβ16–40的C端和N端β-股結合的ZAβ3的β股分別定義為Zstrand1和Zstrand2。首先將ZAβ3與Aβ16–40復合物放入一個長方形(5.4 nm × 5.6 nm × 4.8 nm)盒子中，然后向該盒子加入水分子，水分子模型為TIP3P。最后加入8個Na+中和模擬體系。

2.2 分子動力學模擬

利用NAMD程序進行MD模擬12，力場為全原子CHARMM2713。MD模擬過程主要包括能量最小化、平衡和動力學采樣。模擬體系經能量最小化后，首先限制所有蛋白質原子的運動，僅讓溶劑自由運動。這樣可以去除體系中的局部能量較大的蛋白質-溶劑分子之間的接觸，保證初始體系的穩定。此模擬時間為10 ps。然后在等溫等壓和等容等溫條件下平衡模擬體系，分別做100 ps。然后將平衡好的模擬體系在等溫等容系綜下模擬20 ns。所有模擬體系的溫度均設為298 K，并采用Nose-Hoover方法維持恒溫14。粒子的運動遵循Langevin方程，在周期性邊界條件下長程作用的庫倫力采用Particle-Mesh-Ewald(PME)算法來計算15。非鍵相互作用的截斷距離1.2 nm，并用switch函數修正來減少計算誤差。所有氫原子的共價鍵采用SHAKE算法限制16，其積分步長設為2 fs。MD模擬過程中應用周期性邊界條件。在模擬過程中每40 ps輸出一次坐標文件。為了保證模擬結果的可靠性，進行了三次獨立性重復實驗。

圖1 (a) ZAβ3與Aβ16–40復合物模擬前后構象疊合圖和(b) Aβ16–40, ZAβ3及其野生型Zwt氨基酸序列

Mutated residues are underlined. The sequences of the secondary structures of α-helix or β-sheet in the ZAβ3:Aβ16–40complex are indicated by purple cylinders or yellow arrows, respectively. color online.

2.3 分析方法

2.3.1 MM-PBSA計算方法

本研究采用MM-PBSA方法計算每個ZAβ3-Aβ16–40復合物的結合自由能(Δbind)17,18。根據式(1)，Δbind為分子間作用能(Δgas)、溶劑化作用能(Δsol)和熵作用項(?)的總和。

括號<…>表明是所有模擬得到的能量項的平均值。代表絕對溫度，為溶質熵。gas包含分子間靜電作用項(elec)、范德華作用(vdW)項(vdw)和內能項(inter)。由于本研究根據相同的模擬軌跡進行取樣分析，因此內能項(inter)為019。因此，本文中的ZAβ3與Aβ16–40復合物之間的自由能為相對自由能，而不是絕對自由能。故Δgas對結合自由能的貢獻是Δelec和Δvdw的總和，見式(2)。

溶劑化作用能包含靜電溶劑化能(PB)和非極性溶劑化能(np)，如式(3)所示。

使用CHARMM程序的PBEQ模塊求解線性泊松-玻爾茲曼方程(PB)得到PB。在所有的PB計算中，溶質和溶劑介電常數分別設為1和80。Hou等17研究發現，當目標蛋白質的結合腔疏水性較強，且目標蛋白質和配基之間僅存在較弱的靜電相互作用時，溶質介電常數設為1是最佳選擇。此外，Wang和Kollman20研究了在溶劑介電常數為80時，溶質介電常數分別設為1和2時HIV野生型及其突變體二聚體之間的結合自由能。結果表明，當溶劑介電常數為80時，溶質介電常數分別為1和2時，雖然結合能的數值不一樣，但二聚體及其突變體之間的結合自由能的排列順序一致。當溶質介電常數為2時，其結合自由能相對于介電常數為1時的更負！由于本研究的ZAβ3-Aβ16–40之間的作用力主要為疏水相互作用，而靜電相互作用作用較弱。此外本研究只是計算這些殘基的相對結合自由能而不是絕對結合自由能。因此，本研究選擇了溶質介電常數為1。離子強度為0。溶劑分子半徑為0.14 nm。np是溶劑空穴作用項和溶質-溶劑范德華作用項之和，由式(4)計算得到：

常數和分別為2.27 kJ?mol?1?nm?2和3.85 kJ?mol?1。SASA代表溶劑可及表面積。

2.4 自由能分解

每個殘基的自由能貢獻分解為極性(polar)和非極性作用(nonpolar)，見式(5)。其中每一項繼續分解為兩個能量項之和，見式(6)和(7)。在接下來的分析中，polar和nonpolar分別是殘基的靜電和疏水作用貢獻。需要注意的是residue只分解為polar和nonpolar。

每個殘基的靜電作用能(polar)等于分子間靜電作用能(elec)和靜電溶劑化能(PB)的總和。每個殘基的靜電作用貢獻由式(8)計算得到。線性PB方程允許將靜電溶劑化能分解為每個原子的貢獻。

ZAβ3上每個殘基的范德華作用能貢獻等于該殘基與Aβ16–40片段之間范德華作用能的一半，對于Aβ16–40片段上每個殘基的范德華作用能也遵循此原則。每個殘基的非極性溶劑化作用能與該殘基的溶劑可及表面積的損失成比例，見式(4)。

3 結果與討論

3.1 結構穩定性

ZAβ3是Hoyer等11利用噬菌體展示篩選得到的一種能夠特異性結合Aβ16–40單體的蛋白質。從圖1(a)可以看出，兩個ZAβ3單體間通過一個二硫鍵形成一個中空的疏水性空腔，ZAβ3單體的β-股與Aβ16–40的β-股相互作用，形成一個穩定的復合物。本研究以ZAβ3與Aβ16–40復合物為初始結構，首先利用MD模擬研究了該復合物的結構穩定性。圖2所示為ZAβ3與Aβ16–40復合物三次MD模擬軌跡的均方根偏差(RMSD)的平均值隨模擬時間的變化。三條獨立MD軌跡的RMSD值隨模擬時間的變化放在附圖S1(見Supporting Information)中。從圖2可以看出，在模擬初始的1 ns內，ZAβ3與Aβ16–40的RMSD值急劇上升到0.15 nm，在接下來的19 ns內它們的RMSD值均穩定在0.15–0.25 nm之間。這說明該復合物的結構非常穩定。圖1(a)為20 ns MD模擬前后ZAβ3與Aβ16–40復合物疊合后的三維結構。從圖1(a)可以看出，ZAβ31和ZAβ32的α-螺旋鏈接處由初始的螺旋結構均轉換成轉角結構。此外，Aβ16–40的C末端相比較初始結構變得更加彎曲。除此之外，MD模擬前后ZAβ3與Aβ16–40復合物的結構基本一致。上述研究結果均說明ZAβ3與Aβ16–40之間有較強的親和性。

圖2 ZAβ3與Aβ16–40復合物非氫原子與其初始結構的均方根偏差隨模擬時間變化

3.2 結合能自由分解

3.2.1 多肽鏈間結合自由能分解

為了解析Aβ16–40和ZAβ3復合物之間的結合自由能，本文選取了三條20 ns的MD模擬軌跡中的最后5 ns的125幀構象進行MM-PBSA計算。Hou等17的研究結果表明，MD模擬長度和構象選取個數對MM-PBSA的影響較小。他們的研究結果表明利用100個構象和600個構象的MM-PBSA的計算結果基本一樣?；诖?，本研究也僅從最后5 ns中提取125幀構象進行結合自由能計算，即本研究的MM-PBSA的結果是基于375幀構象的平均值。首先基于三次MD模擬軌跡計算Aβ16–40與ZAβ3之間的結合自由能，并將其分解到每一個氨基酸殘基上，如圖3(a)所示。本研究采用±10.5 kJ?mol?1的標準來識別對自由能貢獻大的殘基19。從圖3(a)可以看出，Aβ16–40與ZAβ3結合的關鍵氨基酸殘基主要為以下14個：F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。圖3(b)所示為Aβ16–40結合ZAβ3過程中起關鍵作用的氨基酸殘基的分布。將其與Aβ17–42五聚體間的作用力分解比較發現，其中有11個殘基(F19、F20、A21、D23、K28、I32、L34、M35、V36、G38和V40)在Aβ聚集過程中同樣發揮重要的作用21。因此，ZAβ3通過封閉Aβ聚集過程中的上述關鍵氨基酸殘基來穩定Aβ單體，這是設計Aβ聚集有效抑制劑的必要條件之一。

從圖1(a)可以看出，ZAβ31與Aβ16–40的C端相鄰，因此其與Aβ16–40的主要作用部位集中在Aβ的C端β-股(G29-V36)。MM-PBSA自由能計算結果表明，Aβ16–40與ZAβ31的總結合自由能為?180.28 kJ?mol?1，其中β2區的貢獻為?128.70 kJ?mol?1，而β1區(L17-G25)與ZAβ31的結合自由能僅為3.89 kJ?mol?1，表明ZAβ31與β2區之間有較強的親和作用，而與β1區的作用很弱。進一步分析發現，Aβ16–40的β2區與ZAβ31的關鍵氨基酸殘基主要為I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40(圖3)。此外，Aβ16–40的D23和K28這兩個帶電關鍵氨基酸殘基與ZAβ31間的結合自由能均較大，主要由于這兩個殘基含有較長的帶電側鏈。

圖3 ZAβ3-Aβ16–40復合物中Aβ16–40中各殘基結合自由能貢獻(a)及其關鍵殘基分布(b)

ZAβ32與Aβ16–40的N端接近，其與Aβ16–40之間的總結合自由能是?254.31 kJ?mol?1，其中Aβ16–40的β1區結合自由能貢獻為?230.94 kJ?mol?1，β2區貢獻僅為?30.94 kJ?mol?1。因此，ZAβ32主要與Aβ16–40的β1區有較強的親和作用力，而與Aβ16–40的β2區作用力很弱。早期的研究證明，E22和D23是形成Aβ聚集體的關鍵氨基酸殘基22。由于這兩個氨基酸含有帶電側鏈，且靜電作用隨構象以及空間距離的變化較大，從而使這些氨基酸貢獻的結合自由能的計算標準偏差較大。例如，D23與ZAβ32的結合自由能最大達到(?103.37 ± 66.11) kJ?mol?1，E22則貢獻了(?39.52 ± 26.29) kJ?mol?1。說明ZAβ32與這兩個帶電關鍵氨基酸殘基的強烈作用對抑制Aβ聚集起到非常重要的作用。

綜上所述，ZAβ31主要作用于Aβ16–40的β2區，尤其與β2區的關鍵氨基酸殘基I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40作用更強烈；ZAβ32主要作用于Aβ16–40的β1區，其關鍵氨基酸殘基為F19、F20、A21、E22、D23、K28和G29。此外，ZAβ31和ZAβ32都與Aβ16–40的帶電氨基酸D23和K28有較強的作用。主要原因是這兩個氨基酸的側鏈帶有負電荷，而靜電相互作用是長程作用力。ZAβ3通過封閉Aβ的關鍵氨基酸殘基和關鍵肽段來抑制Aβ聚集形成纖維狀結構，同時這些關鍵氨基酸殘基和關鍵肽段與前期Aβ17–42五聚體復合物單體間結合自由能解析所得到的結果一致21。另外值得注意的是，抑制Aβ聚集需要ZAβ3二聚體共同作用，缺少任何一條都很難達到這樣的效果。此外，ZAβ3和Aβ之間的作用力主要分為以下兩種：一是封閉β區段的關鍵氨基酸殘基，從而阻斷Aβ單體間的結合；二是封閉Aβ的關鍵氨基酸殘基D23和K28，使其不能形成鏈間鹽橋。因此可以得出兩條多肽鏈所組成的穩定空間結構對抑制Aβ聚集也起到非常重要的作用，這種結構為抑制Aβ間相互作用提供了非常有利的環境。

為了進一步研究ZAβ3的關鍵氨基酸殘基，將ZAβ3與Aβ16–40的結合自由能分解到ZAβ31和ZAβ32的氨基酸殘基上，如表1所示。為了使該表格簡潔易讀，本表格中僅列出了自由能絕對值大于10.5 kJ?mol?1的殘基。ZAβ3中每個殘基對Aβ16–40的結合自由能列入Supporting Information中的表S1。從表1和表S1可以看出，ZAβ3對Aβ16–40的結合作用主要集中在ZAβ3N端的E15–L22肽段(即Zstrand1和Zstrand2)，即ZAβ3與Aβ16–40相互作用的關鍵殘基為E15、I16、V17、Y18、L19和P20，這些研究結果與Wang等23的研究結果一致。從圖1(a)可以看出，ZAβ3的Zstrand2和Zstrand1分別與 Aβ16–40的疏水核心區β1和β2結合并形成反平行的β-折疊結構。相對于β-折疊結構的E15?Y18，殘基L19?L22是轉角結構，構象變化較大，因此與Aβ16–40的某些殘基同樣有較強的結合作用力。此外，ZAβ32的P38?S41靠近Aβ16–40的轉角區域，因此該區域所含的氨基酸殘基P38和S41也與Aβ16–40之間有較強的親和作用。此外，處于α-螺旋結構中的L45也是關鍵氨基酸殘基。進一步從氨基酸殘基的理化性質分析發現，除E15之外，其它殘基均為疏水性氨基酸，因此Zstrand1和Zstrand2與它們相連的四個螺旋結構形成一個疏水性空腔。通過兩個Zstrand與Aβ16–40的兩個β股發生相互作用，阻礙Aβ單體之間的結合。因此，ZAβ3的β股和無規卷曲區域P38–S41是其與Aβ單體結合的關鍵區域。雖然α-螺旋與Aβ單體的結合作用很小，但其圍成的中心對稱空間結構對穩定Aβ單體以及阻礙另一條單體的靠近具有很重要的意義。

表1 ZAβ3-Aβ16–40復合物中ZAβ3中各氨基酸殘基結合自由能的貢獻(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included.

3.2.2 主鏈和側鏈的結合自由能

為了進一步研究ZAβ3與Aβ16–40復合物多肽鏈間氨基酸殘基主鏈和側鏈對結合自由能的貢獻，將每一個氨基酸殘基對結合自由能的貢獻進一步分解到每個氨基酸的主鏈和側鏈上。圖4為Aβ16–40的每個殘基的主鏈和側鏈對ZAβ3的結合自由能的貢獻。從圖4(a)可以看出，Aβ16–40與ZAβ31的總結合自由能為?193.43 kJ?mol?1，其中主鏈的貢獻為?140.17 kJ?mol?1，約占73%，這說明Aβ16–40主要通過主鏈與ZAβ31結合，尤其是β2區的氨基酸殘基I32、G33、L34、V36、G37、G38和V40。而Aβ16–40與ZAβ32的總結合自由能為?236.30 kJ?mol?1，主鏈和側鏈的貢獻分別為?90.18和?146.08 kJ?mol?1。即Aβ16–40與ZAβ32之間的作用中，側鏈的貢獻稍大一些，主要是因為帶電殘基E22和D23的側鏈貢獻比較大，如圖4(b)所示。而主鏈貢獻較大的關鍵殘基為F19、F20、A21和D23?？傊贏β16–40與ZAβ3結合的關鍵氨基酸殘基中，除了帶電氨基酸殘基E22、D23和K28外，其余關鍵氨基酸殘基在多肽鏈結合過程中均是主鏈起主要作用。

表2為ZAβ3的每個殘基的主鏈和側鏈對Aβ16–40的每個殘基的結合自由能貢獻。與表1類似，表2僅列出了自由能絕對值大于10.5 kJ?mol?1的殘基。ZAβ3中每個殘基的主鏈和側鏈對Aβ16–40的結合自由能列入附件的表S2中。從表2和S2可以看出，ZAβ31對Aβ16–40結合自由能的貢獻主要集中在β-股(即E15–L22)。該關鍵區段殘基的主鏈和側鏈對相鄰多肽鏈結合自由能均有利于它們之間的結合。ZAβ31與Aβ16–40的結合自由能為?217.63 kJ?mol?1，主鏈和側鏈的貢獻分別為?129.92和?87.76 kJ?mol?1，分別約占60%和40%，而β-股的氨基酸殘基的主鏈和側鏈對Aβ16–40的結合自由能分別占到整個蛋白質的主鏈和側鏈貢獻的87%和90%，這說明ZAβ31的β-股是與Aβ16–40結合的主要區段。其它殘基對Aβ16–40的結合作用很小。通過將這些關鍵氨基酸的結合能分解到殘基的主鏈和側鏈上，從表2可以看出，除了殘基Y18外，其它氨基酸的主鏈貢獻大于側鏈。例如，Y18的主鏈僅貢獻?38.39 kJ?mol?1，而其側鏈與Aβ16–40的結合能卻高達?46.10 kJ?mol?1。ZAβ32每個殘基的主鏈和側鏈對Aβ16–40的每個殘基的結合自由能貢獻與ZAβ31的結果類似。除了殘基E15之外，β股的氨基酸殘基的主鏈和側鏈與Aβ16–40的結合能的貢獻均為負。除了殘基Y18、P38和L45之外，氨基酸主鏈的貢獻均要大于側鏈。尤其是殘基P38和L45，它們與Aβ16–40之間的作用力主要由側鏈提供。

圖4 ZAβ3-Aβ16–40復合物中Aβ16–40氨基酸殘基主鏈和側鏈對(a) ZAβ31和(b) ZAβ32結合自由能分解

表2 ZAβ3-Aβ16–40復合物中ZAβ31和ZAβ32氨基酸殘基的主鏈和側鏈對Aβ16–40結合自由能分解(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included.

3.2.3 不同類型的結合自由能

為了進一步深入分析ZAβ3和Aβ16–40之間的作用力類型，將每一個氨基酸殘基的結合自由能分解成三種類型的結合自由能：靜電作用能(elec)、范德華作用能(vdW)和溶劑化非極性作用能(sas)，并基于此來判斷ZAβ3與Aβ16–40之間的作用力類型。圖5所示為Aβ16–40氨基酸殘基對ZAβ31和ZAβ32的結合自由能分解。從圖5(a)可以看出，Aβ16–40-ZAβ3復合物中大多數氨基酸殘基的范德華作用和溶劑化非極性作用都有利于多肽鏈之間的結合。其中，L34的范德華作用力貢獻最大，約為?13.48 kJ?mol?1。除了殘基F19、A21、D23和A30之外，Aβ16–40的其它殘基與ZAβ3之間的靜電作用均有利于Aβ16–40和ZAβ3之間的相互作用，且D23、K28、I32、L34、V36和G38的絕對值大于10.5 kJ?mol?1。在Aβ16–40與ZAβ32的結合自由能分解也有類似的結果，如圖5(b)所示。從圖5(b)可以看出，殘基F19、A21、E22和D23的靜電相互作用要大于vdW和sas的貢獻。尤其是對于兩個帶電殘基E22和D23，它們貢獻的靜電相互作用分別為?38.39和?56.81 kJ?mol?1。與這兩個帶電殘基相反，殘基K28的靜電相互作用為21.56 kJ?mol?1，表明K28不利于Aβ16–40與ZAβ32的結合。

表3和表S3所示為ZAβ31和ZAβ32對Aβ16–40氨基酸殘基的結合自由能分解。從表S3可以看出，在ZAβ3與Aβ16–40的結合過程中，β股所含的大多數氨基酸殘基與Aβ之間的靜電作用、范德華作用和溶劑化非極性作用都有利于復合物多肽鏈之間的結合。首先分析Aβ16–40氨基酸殘基對ZAβ31的自由能分解結果。相對于靜電和范德華作用，雖然多肽間的溶劑化非極性作用均有利于Aβ-ZAβ之間的相互作用，但其貢獻較小(表S3)。ZAβ31的β股包含的殘基V17、Y18、L19、P20、N21和L22與Aβ之間的靜電作用有利于復合物的結合，且其絕對值均大于10.5 kJ?mol?1。而ZAβ32只有殘基V17、L19和P20的靜電作用的絕對值大于10.5 kJ?mol?1。范德華作用的情況與靜電作用類似，但其貢獻稍低于靜電相互作用。例如，ZAβ31和ZAβ32只有三個疏水性殘基I16、Y18和L19的范德華作用的絕對值大于10.5 kJ?mol?1(表3)。

3.3 ZAβ3親和結合Aβ16–40模式

ZAβ3的結構框架來源于金黃色葡萄球菌的蛋白A的Z結構域，其含有58個氨基酸殘基(圖1(b))，然后利用噬菌體展示技術，選擇螺旋1和2區域內的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、31和34位氨基酸進行了隨機突變，并經過反復篩選最終獲得與Aβ有較高親和性的ZAβ。從圖1可以看出兩個ZAβ3的多肽鏈組成了完美的腔體結構-Z結構域(圖6a)。每條多肽鏈由兩個α-螺旋和一個β股組成，MM-PBSA分解結果確定ZAβ3主要通過β股上的氨基酸殘基E15、I16、V17、Y18、L19、P20、N21和L22和Aβ16?40發生作用。其中，ZAβ31與Aβ16–40的β2區的關鍵氨基酸殘基I32、L34和V36以及帶電氨基酸殘基D23、K28結合，而ZAβ32卻與Aβ16–40β1區的關鍵氨基酸殘基F19、F20和A21以及帶電氨基酸殘基E22和D23結合(圖6(a))。基于上述MM-PBSA自由能計算和分解結果，構建了ZAβ3的結合模式圖(圖6(b))。雖然ZAβ3的α-螺旋結構與Aβ16–40的結合作用很小，但其四個α-螺旋形成中心對稱的“Z”結構域可以將Aβ16–40單體結合在該腔體內，并利用空間位阻效應阻礙了其它Aβ16–40單體的靠近。在ZAβ3的Zstrand的親和吸附和“Z”結構域的狹窄腔體內，Aβ16–40單體以β-折疊的形式存在，它的兩個β股與ZAβ3的Zstrand形成反平行的β-折疊結構。ZAβ3競爭性和選擇性地與Aβ16–40單體結合，從而有效地抑制了Aβ纖維狀聚集體的形成。ZAβ3的這種結構模式已用于多種淀粉質蛋白質如Aβ4224，hIAPP25和α-突觸核蛋白26的抑制劑開發中。

圖5 ZAβ3-Aβ16–40復合物中Aβ16–40氨基酸殘基對(a) ZAβ31和(b) ZAβ32的結合自由能分解

The van der Waals (vdW), the nonpalor (sas) , the electrostatic (elec) contributions, are displayed separately for every residue of Aβ16–40. color online

表3 ZAβ3-Aβ16–40復合物中ZAβ31和ZAβ32氨基酸殘基對Aβ16–40的結合自由能分解(kJ?mol?1)

The residues with small free energy ranging from ?10.5 to 10.5 kJ?mol?1are not included. elec, electrostatic contribution; vdW, van der Waals contribution; sas, nonpalor solvation contribution.

基于上述研究結果，發現對Aβ具有最佳抑制效果的蛋白質類(包括短肽)抑制劑通常需要具有如下三個要素：一是具有與Aβ強烈結合的多肽片段，從而使蛋白質類抑制劑能夠通過這些片段競爭性地與Aβ單體結合，起到阻止Aβ分子相互聚集的目的，這是蛋白質類抑制劑具有較強抑制效果的必要因素；此外，若要達到選擇性結合Aβ的目的，最好結合片段也是β-股結構；二是空間結構較大的附屬結構，這部分的選擇范圍比較廣，ZAβ3的附屬結構為α-螺旋，也可以是親水性強且空間結構較大的有機分子，它主要是利用空間位阻效應，阻止另一條Aβ單體的靠近，從而切斷了Aβ單體間結合的通道，有效地抑制了Aβ寡聚體或者淀粉樣纖維的形成；三是穩定構象，例如ZAβ3分子之間形成一個二硫鍵來穩定其“Z”型構象?；谝陨辖Y論可以提煉出Aβ有效蛋白質類抑制劑的設計三原則：核心結合片段、空間結構較大的附屬結構和穩定構象。利用這種作用模式已開發出多種蛋白質抑制劑如HI1827、β-wrapin28和β-wrapin AS1029。其中，β-Wrapin AS10蛋白質抑制劑能夠同時結合Aβ、α-突觸核蛋白和hIAPP，并抑制它們的聚集沉淀和細胞毒性。

上述原則同樣適用于多肽類抑制劑的設計。一般情況下，Aβ短肽抑制劑的設計思路是僅考慮第一要素，即選擇和設計與Aβ單體具有較高親和作用的短肽，而忽略了另外兩個因素。所以目前大多數的短肽抑制劑主要為Aβ核心片段及其突變體，如KLVFF30、VVIA31、LPFFD32和LVFFARK8。分析這些短肽抑制劑會發現，它們均含有β-股結構且與Aβ的β股有較強的親和作用力，因此這些短肽與Aβ單體之間的親和作用力能夠破壞Aβ單體之間的疏水和靜電作用(包含氫鍵)，從而抑制Aβ聚集。但由于這些短肽固有的疏水性較強等理化性質，從而使這些多肽抑制劑非常易于自聚，且有的聚集體的毒性遠大于Aβ聚集體的。例如，基于Aβ結構設計獲得的短肽抑制劑LVFFARK就存在此缺點8。雖然短肽抑制劑LVFFARK抑制Aβ42聚集的能力很強且抑制Aβ42聚集的效果隨抑制劑濃度的增加而增加，但當LVFFARK和Aβ42濃度比大于1 : 1后LVFFARK濃度的增加反而降低了多肽類抑制劑的抑制效果。主要原因就是LVFFARK非常易于自聚，從而在高濃度下大大降低了其抑制Aβ42聚集的效果。為了克服此缺點，將LVFFARK偶聯到納米粒子上獲得納米抑制劑，最后獲得高效的短肽修改的納米抑制劑8。發現該納米抑制劑既能有效抑制Aβ，同時抑制了LVFFARK的自聚及其毒性。借鑒ZAβ3作用模式，后期可以將傳統的多肽抑制劑偶聯到空間體積較大的附屬結構(如結構較大的親水性有機分子或含有結構穩定的α-螺旋結構的蛋白質等)或納米粒子上。利用這些抑制劑的親和部位封閉Aβ的關鍵氨基酸殘基競爭性地與Aβ單體結合，另一方面利用附屬結構的空間位阻效應阻礙另一條單體的靠近，從而達到抑制Aβ聚集的雙重效果。

圖6 (a) ZAβ3-Aβ16–40之間的作用力解析和(b) ZAβ3的簡單結合模式

The hot spots of Aβ16–40are shown in VDW model. Atoms of these hot spots are colored red for oxygen, white for hydrogen, and green for carbon. The hot spots are displayed by licorice model, and hydrophobic residues I16, V17, Y18, L19, P20 and L22 are colored in white. Hydrophilic residue N21 and negative residues E15 are colored in green and red, respectively. color online.

4 結論

基于全原子MD模擬軌跡，利用MM-PBSA自由能計算和分解方法計算了多肽抑制劑ZAβ3和Aβ16–40復合物之間的結合自由能計算并將其分解到每個氨基酸殘基上，得出了結合蛋白質ZAβ3穩定并抑制Aβ聚集的分子機理。結論如下：

(1) Aβ16–40與ZAβ3作用的關鍵氨基酸殘基是F19、F20、A21、E22、D23、K28、I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40。這些殘基也在Aβ自聚過程中發揮關鍵作用。因此，抑制劑ZAβ3正是通過封閉Aβ的關鍵氨基酸殘基來抑制Aβ聚集。

(2) 模擬體系中兩個ZAβ3分別對應的β股Zstrand1和Zstrand2分別與Aβ16–40的C端和N端結合。β-股是ZAβ3與Aβ16–40作用的結合位點。其中ZAβ31的β-股Zstrand1與Aβ16–40的C端關鍵氨基酸殘基I31、I32、G33、L34、M35、V36、G38和V40以及帶電氨基酸殘基D23和K28的結合作用力比較強；ZAβ32的β-股Zstrand2與Aβ16–40的N端關鍵氨基酸殘基F19、F20、A21以及帶電氨基酸殘基E22、D23和K28的結合作用力強。通過兩個肽鏈的共同作用，很好地封閉了Aβ單體間結合的關鍵氨基酸殘基，競爭性和選擇性地與Aβ單體的結合，抑制Aβ聚集。

(3) ZAβ3的螺旋結構與Aβ16–40的結合自由能很小。這說明α-螺旋結構在ZAβ3與Aβ16–40結合的過程中并不是直接作用，而是通過空間位阻作用阻礙另一條Aβ單體的靠近，從而切斷Aβ單體間聚集的通道，達到抑制Aβ的聚集。

(4) 基于上述研究結果獲得了ZAβ3二聚體與Aβ16–40的結合模式：高親和性的結合片段(β-股)，附屬結構和穩定的構象。其中，高親和性結合片段能夠競爭性地與Aβ單體結合，附屬結構可以阻礙其它Aβ單體靠近和聚集。這兩個要素均要建立在有穩定的構象基礎上，因此三者協同作用才可以有效地抑制Aβ聚集。

致 謝：本論文所有作者特別感謝來自天津科技大學海洋與環境學院的李麗老師對本文中圖片的加工和語言的潤色。

Supporting Information:available free of chargethe internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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Molecular Mechanism Underlying Affinity Interactions between ZAβ3and the Aβ16–40Monomer

LIU Fu-Feng1,2,3,4FAN Yu-Bo1LIU Zhen1BAI Shu1,*

(1;2;3;4)

Alzheimer’s disease (AD) is mainly caused by the aggregation of amyloid-β (Aβ) protein. Development of inhibitors to prevent Aβ aggregation is the most efficient method to devise a cure for AD. Aβ aggregation has been found to be inhibited by the affibody protein ZAβ3, selectedphage display. However, the molecular basis of affinity interactions between Aβ and ZAβ3, the interaction region, and important residues of Aβ and ZAβ3remain unclear. Herein, molecular dynamics simulations and free energy calculation and decomposition using the molecular mechanics-Poisson-Boltzmann surface area method (MM-PBSA) were coupled to investigate the molecular mechanism underlying interactions between Aβ and ZAβ3. Interactions between the β-strand of ZAβ3and Aβ16–40were found to contribute greatly to their binding free energy, while that between the α-helix of ZAβ3and ZAβ3has a smaller contribution. Based on the free energy decomposition, hotspot residues of ZAβ3are E15, I16, V17, Y18, L19, P20, N21, and L22 and those of Aβ16–40include F19, F20, A21, E22, D23, K28, I31, I32, G33, L34, M35, V36, G38, and V40. ZAβ3stabilizes the β-sheet by burying the two mostly nonpolar faces of the Aβ hairpin within a large hydrophobic tunnel-like cavity formed by the α-helix. The identified binding motif can be used as a starting point for rational design of protein inhibitors with high affinity for Aβ to prevent Aβ aggregation. The three key characteristics of efficient protein inhibitors are the presence of a high-affinity site (β-strand), a large accessory structure (α-helix), and a stable conformation owing to disulfide bonds. The high-affinity site can competitively bind to the Aβ monomer, and the large accessory structure can block other Aβ monomers; both these elements require a stable conformationdisulfide bonds. These three characteristics of a protein inhibitor can be employed together to suppress Aβ aggregation.

Protein inhibitor; Amyloid-β protein; Molecular dynamics simulation; Free energy decomposition; Molecular mechanism

January 26, 2017;

April 19, 2017;

April 27, 2017.

. Email: sbai@tju.edu.cn; Tel: +86-22-27404981.

10.3866/PKU.WHXB201704274

O641

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (21576199).

國家自然科學基金(21576199)資助項目