電針對心肌缺血大鼠心肌組織中LncRNA差異表達的影響

薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬 隆 董亞琴 許金森

(福建省中醫藥研究院 福建省經絡感傳重點實驗室，福建 福州 350003)

電針對心肌缺血大鼠心肌組織中LncRNA差異表達的影響

薩喆燕 潘曉華 黃倩茹 萬 隆 董亞琴 許金森

(福建省中醫藥研究院 福建省經絡感傳重點實驗室，福建 福州 350003)

目的探討長鏈非編碼RNA (LncRNA)在急性心肌缺血大鼠和電針組大鼠心肌組織中的表達差異。方法18 只 SD大鼠隨機分為模型組、電針組、生理鹽水對照組，每組6只。模型組、電針組用皮下多點位注射鹽酸異丙腎上腺素(ISO)制備急性心肌缺血大鼠模型，電針組電針內關穴5 d，比較各組心電圖ST段偏移幅度；采用LncRNA 芯片檢測模型組和電針組大鼠心肌組織LncRNA的表達差異，篩選出電針治療心肌缺血相關的LncRNA。結果與模型組比較，電針組ST段偏移較小；上調和下調超過2倍的LncRNA共153條。與模型組比較，電針組大鼠LncRNA表達譜變化顯著。結論LncRNA可能在電針治療心肌缺血過程中發揮一定作用。

長鏈非編碼RNA；心肌缺血；電針

臨床研究顯示，針刺治療冠心病有一定療效〔1～4〕，但其機制仍不十分明確。近年來，基因組學技術的發展為針刺研究開辟了一條新的思路。在人類基因組中，僅有1.2% 的基因能編碼蛋白質，而非編碼RNA在轉錄組中的含量高達98%以上，暗示非編碼RNA可能在生物體內具有豐富的生物學功能〔4〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)就是一類細胞內源性的非編碼RNA小分子，它們不編碼蛋白質，長度超過200個核苷酸單位。相比于蛋白編碼基因，LncRNA的表達譜有更高的細胞特異性，在生物體發展階段同時發生分化，參與表觀基因的沉默、剪切調控、翻譯水平的調控和小RNA的形成等重要過程〔5,6〕。目前關于LncRNA與針刺療效的相關研究鮮有報道。本研究采用LncRNA 芯片技術篩選電針治療心肌缺血過程中差異表達的LncRNA及可能與電針療效相關的LncRNA，以期進一步闡明針刺治療心肌缺血的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 成年雄性SD 大鼠18 只，清潔級，質量(250±20)g，購自福建醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(閩)2012-0001。實驗前7 d適應性飼養于福建省中醫藥研究院實驗動物中心，飼養條件：溫度(22±2)℃，濕度(55±15)%，12 h明暗交替，自由進食與飲水。大鼠隨機分為模型組、電針組、生理鹽水對照組，每組6只。

1.1.2主要實驗儀器 Powerlab 多導數據采集分析系統(澳大利亞埃德公司)；小動物麻醉呼吸系統(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司)。LncRNA 芯片由美國Arraystar 公司中國唯一代理商上海康成生物工程有限公司提供。

1.1.3主要試劑 鹽酸異丙腎上腺素(ISO)購于美國Sigma公司，使用時配制成濃度為50 mg/ml的溶液。

1.2方法

1.2.1模型制備 首先大鼠連接小動物呼吸麻醉機，吸入異氟烷，在麻醉狀態下，通過PowerLab多導生理記錄儀記錄正常狀態下大鼠心電圖(ECG)。然后予皮下多點位(大鼠四肢內側根部和背部)注射ISO(85 mg/kg)，注射2次，間隔24 h。確認造模成功的ECG標準：T 波由正向變為負向或雙相，并伴S-T 段抬高。對照組在皮下多點位注射生理鹽水(85 mg/kg)，注射2次，間隔24 h。

1.2.2干預措施 電針組參考《實驗針灸學》，選左側內關穴，選用0.25×13 mm華佗牌無菌毫針，直刺0.1 cm，連接SDZ-Ⅱ電針儀，電壓5～10 V，以針體輕微抖動為度，疏密波，頻率2/10 Hz，每次20 min，1 次/d。第二次注射ISO后24 h開始治療， 連續5 d。模型組和對照組給予同等條件抓取，不做任何治療。

1.2.3ECG分析 治療結束后分別記錄各組大鼠的ECG，各取5個心動周期，以TP連續為基線，測量ST段電位偏移變化，作為評價心肌缺血程度的指標。

1.2.4樣本采集 模型組和電針組隨機各選取3只大鼠，于干預結束后立即處死，取新鮮左心室心肌組織-80℃保存用于LncRNA檢測。

1.2.5芯片信息 Arraystar大鼠LncRNA芯片v2.0是為研究大鼠全局LncRNAs和蛋白質編碼轉錄本而設計的，能夠檢測13 611個LncRNAs和24 626個蛋白質編碼轉錄本。LncRNAs是從權威數據庫(包括NCBI RefSeq、Ensembl、LncRNAdb等)和高影響因子論文中仔細收集的。

1.2.6樣品標記和芯片雜交 根據Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實驗方案(美國Agilent Technology公司)執行：從總RNA中移除rRNA后，得到mRNA(美國mRNA-ONLYTMEukaryotic mRNA Isolation Kit，Epicentre公司)；使用隨機引物方法將每個樣品放大并轉錄成帶熒光的cRNA；用RNeasy Mini Kit (美國Qiagen公司)純化標記的cRNAs，并用NanoDrop ND-1000檢測RNA量和質量，通過標準變性凝膠電泳評估RNA完整性；隨后進行芯片雜交、洗滌、固定。

1.2.7圖像采集和數據分析 采用Agilent DNA Microarry Scanner (G2505C)掃描芯片，通過Agilent Feature Extraction軟件采集芯片探針信號值，在Agilent GeneSpring GX軟件中進行數據分析。經過標準化處理后，得出電針組與模型組標記的信號比值(fold change)，即為該基因組在電針組與模型組中的變化情況。最后經過t檢驗，按照fold change≥2、P<0.05的標準進行篩選，得到差異表達的LncRNA列表。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗、方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

2.1ECG變化 皮下注射ISO后，模型組、電針組ST段偏移值均顯著高于造模前(P<0.01)，對照組ST段電位無顯著變化(P>0.05)，提示急性心肌缺血模型制備成功，見圖1。干預處理后，模型組大鼠ST段偏移值〔(396.18±47.42)μV〕顯著高于對照組〔(97.54±26.28)μV〕(P<0.01)，而電針組ST段偏移值〔(169.63±37.22)μV〕明顯低于模型組(P<0.01)，可見電針可以減輕大鼠心肌缺血程度。

與模型組造模前相比：1)P<0.01；與電針組造模前相比：2) P<0.01圖1 各組大鼠造模前后Ⅱ導聯ECG ST段電壓比較

2.2RNA樣本質量分析 樣本總RNA 的OD260/280 比值在1.8～2.1，OD260/230>1.8，表明所有樣本的RNA 質量均滿足檢測要求。

2.3芯片雜交結果 模型組與電針組各取3個心肌組織，采用芯片雜交方法對差異表達的LncRNA 進行篩選，利用箱式圖分析發現芯片掃描后各個樣本經過標準化后，樣本的log2-ratios 基本相同，表明六張芯片的數據被調整到近乎相同的水平，確保了得到的基因表達量的變化具有生物學意義，見圖2A。通過散點圖分析，可以直觀分析兩組之間芯片表達數據的分布變化，見圖2B。根據不同樣品間LncRNA表達水平的不同進行分層聚類分析，表達程度越相似的樣品更容易聚類在一起，見圖3。2倍以上差異表達的LncRNA 共153條，其中上調的有52 條，下調的有101 條。表1列出了差異表達的部分LncRNA。

圖2 電針組與模型組中LncRNA表達譜芯片檢測圖

表1 芯片顯示差異表達的部分LncRNA

圖3 電針組和模型組差異LncRNA表達芯片檢測的聚類分析

3 討 論

本研究采用多點皮下注射ISO造成大鼠急性心肌缺血損傷。大劑量注射ISO可激活心肌細胞β受體，使心肌收縮力加強，耗氧量增加；同時擴張外周血管，減少回心血量，導致心肌缺血、缺氧，引發缺血性心肌病。這種損傷與人急性心肌缺血比較相似，因此常作為急性心肌缺血的動物模型之一〔7〕。ISO造成心肌缺血的主要指標可用Ⅱ導聯心電圖ST段的偏移值來評價〔8〕。本研究結果提示電針可以減輕大鼠心肌缺血程度，起到對抗心肌缺血的作用，也為后續進行LncRNA 芯片檢測奠定了實驗基礎。

LncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt 的RNA，雖然其本身不編碼蛋白質，但卻在正常生理過程發揮重要的調控作用，而且LncRNA的異常表達亦可能導致疾病的發生〔9～14〕。作為一種新的生物調節模式，LncRNA在心血管疾病中的研究正處于起步階段，其在疾病中的調控方式及作用機制尚不明確。Yang 等〔15〕比較分析了冠心病患者和正常人血漿，在差異性表達的LncRNA中發現CoroMarker水平最穩定，由此采用Fisher標準建立診斷模型，提出CoroMarker 很可能成為診斷冠心病的一種新型的血漿生物標志物。H19是一種出生后表達降低的LncRNA，但在動脈粥樣硬化患者體內又重新表達，Gao 等〔16〕采用TaqMan技術分析H19基因4個多態位點的基因型，在中國人群中首次發現H19 rs217727多態性與冠心病的發病風險有關。除了臨床研究外，國內外學者們也通過動物實驗對LncRNA進行了深入研究。Liu等〔17〕報道在小鼠心肌缺血再灌注模型中，模型組與對照組相比，差異表達的LncRNA中有64條上調、87條下調。在C57/BL6 小鼠急性心肌梗死模型中也發現，心肌梗死小鼠心臟中有20個LncRNA 表達上調，10 個LncRNA 表達下調，其中升高最顯著的LncRNA：MIRT1和MIRT2與多個已知參與左心室重塑的蛋白質編碼基因相關〔18〕。從研究現狀來看，LncRNA表達與心血管疾病的調控密切相關。

本研究結果證實，電針干預后，急性心肌缺血損傷相關的LncRNA表達譜發生了變化。綜上，筆者認為LncRNA在電針治療心肌缺血過程中發揮了重要作用，但要深入了解LncRNA的參與機制還需對差異表達的LncRNA進一步驗證，同時進行生物信息學分析，從而為闡釋電針對抗心肌缺血的分子機制提供實驗依據。

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EffectsofelectroacupunctureonlongnoncodingRNAexpressionprofilesinmyocardialtissueofmyocardialischemiainrats

SAZhe-Yan,PANXiao-Hua,HUANGQian-Ru,etal.

FujianAcademyofTraditionalChineseMedicine,KeyLaboratoryofPropagatedSensationalongtheChannelsofFujianProvince,Fuzhou350003,Fujian,China

ObjectiveTo explore the effects of electroacupuncture (EA) on expression prolifes of long noncoding RNA of myocardial ischemia in rats.Methods18 SD rats were randomly divided into myocardial ischemia model, EA and control groups(n=6). Myocardial infarction was produced in rats with 85 mg/kg of isoproterenol administered subcutaneously (sc) twice at an interval of 24 h. Rats of EA group were treated with EA for 5 days. ST segment voltages of ECG in all rats were recorded. The expression profiles of LncRNA of the three groups were analyzed through the rat LncRNA microarray.ResultsST segment voltage of EA group was much lower than that of model group. 153 LncRNAs were identified to be different expression (fold change≥2).ConclusionsCompared with model group, there are evidently differentially expressed profiles of LncRNA in EA group. LncRNA might play a role in the treatment of myocardial ischemia by EA.

Long noncoding RNA; Myocardial ischemia; Electroacupuncture

R246

A

1005-9202(2017)23-5755-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.005

國家自然科學基金資助項目(81001505，81403490)；福建省屬公益類科研院所基本科研專項資助項目(2015R1035-14)

許金森(1963-)，男，博士生導師，研究員，主要從事中醫經絡現代研究。

薩喆燕(1979-)，女，博士，助理研究員，主要從事中醫經絡現代研究。

〔2017-02-14修回〕

(編輯 李相軍/徐 杰)