免疫抑制劑血藥濃度兩種檢測方法對比分析

王陸軍

·臨床醫學·

·論著·

免疫抑制劑血藥濃度兩種檢測方法對比分析

王陸軍

目的采用化學發光微粒子免疫法(CMIA)監測2種免疫抑制劑普樂可復和環孢霉素血藥濃度，比較CMIA與酶增強免疫(EMIT)2種方法之間的相關性。方法將檢測對象按測定項目分別用EMIT和CMIA同時進行檢測，以EMIT法為基準進行配對t檢驗和相關性分析。結果普樂可復2種方法相關性r=0.982(P<0.05)，檢測結果偏差為-0.71 μg/L(95%可信區間：-0.91～-0.50 μg/L)，差異有統計學意義(P<0.05)；環孢霉素2種方法相關性r=0.976(P<0.05)，檢測結果偏差為0.57 μg/L(95%可信區間：0.37～0.77 μg/L)，差異有統學意義(P<0.05)。結論CMIA和EMIT均可對該2種免疫抑制劑治療藥物進行濃度檢測，二者之間有良好的相關性，但患者要建立各自新的治療窗范圍。

普樂可復；環孢霉素；化學發光微粒子免疫；酶增強免疫

普樂可復(tacrolimus)、環孢霉素(cyclosporine)是器官移植手術后和自身免疫性疾病常用的免疫抑制劑。二者均有治療窗窄，藥代動力學差異大等特點，臨床使用過程中需經常監測血藥濃度[1-3]。近幾年臨床普遍采用重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶增強免疫法(EMIT)檢測2種藥物的血藥濃度[4-5]；近年美國雅培體外診斷有限公司推出了基于化學發光微粒子的免疫分析技術(CMIA)，應用于ARCHI-TECTi2000或i1000系統的tacrolimus和cyclosporine檢測試劑盒，代替了重組葡萄糖-6-磷酸脫氫酶增強免疫分析法對2種治療藥物進行監測。通過檢測78例次肝移植和/或腎移植患者全血普樂可復和52例次環孢霉素的濃度，比較CMIA與EMIT之間的偏差及相關性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

因各自的標準品、質控品都適用于各自的檢測體系無可比性，通用的質控品難以購買，所以采用本實驗室的130例次臨床樣本進行對比分析，130例次臨床樣本均來自肝移植和/或腎移植患者，標本采集多為口服相應藥前30 min或口服相應藥120 min后，分別抽取2 ml靜脈血，注入EDTA抗凝的血常規管內，顛倒混勻2～3次，所有樣本均采用全血于當日檢測。因本研究是采用自身配對比較，測定中病例的選擇、給藥的方式方法、移植類型、移植時間等因素不會或較小影響2種測定方法的結果，因而未進一步進行影響因素分析。

1.2 儀器與試劑

CIMA法：采用美國雅培體外診斷生物有限公司生產的Architect i2000全自動化學發光免疫分析儀、配套的Tacrolimus和Cyclosporine試劑盒及相應的標準品、質控品和樣本前處理試劑；EMIT法：采用德國西門子公司生產的SYVA Viva-E臨床化學分析儀(簡稱SYVA Viva-E)、配套的Tacrolimus、Cyclosporine試劑盒及相應標準品、質控品和樣本前處理試劑。G16型醫用高速臺式離心機，由河北省安新白洋離心機生產提供，XH-C型漩渦混合器，由江蘇省金壇金偉實驗儀器廠生產提供。50～250 μl、100～1 000 μl加樣器由上海狄氏醫療器械有限公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 EMIT法 測試前開機，按照儀器操作規定常規進行日常保養。用配套的標準品定標后，每次測試用MODE 1標準品對標準曲線進行對比或校正，常規進行室內質量控制。所有試劑盒、標準品、質量控制品和臨床樣本均嚴格按照試劑說明書進行操作：4 ℃冰箱取出各種試劑后平衡至室溫，試劑盒放入儀器試劑槽內，Tacrolimus加200 μl 全血樣本于1.5 ml離心管，然后加入200 μl甲醇，再加50 μl樣本前處理液，充分渦旋混勻，13 000 r/min(r=8 cm)高速離心6 min后，立即將上清液按順序倒入樣品杯，置于樣品架子后立即上機測試。30 min后自動打印測試結果，所有質控品全部在控。Cyclosporine加100 μl 全血樣本于1.5 ml離心管，然后加300 μl環孢霉素樣本預處理試劑，充分渦旋混勻，13 000 r/min高速離心6 min后，同樣立即將上清液按順序倒入樣品杯，置于樣品架子后立即上機測試。30 min后自動打印測試結果，所有質控品全部在控。

1.3.2 CMIA法 該儀器開機后24 h運轉，按照儀器操作規定常規進行日常保養，放置試劑于儀器試劑倉內，用配套標準品定標。所有標準品、質控品和臨床樣品均嚴格按說明進行操作：Tacrolimus加200 μl全血樣品于1.5 ml離心管，然后加入200 μl全血沉淀劑，充分渦旋混勻，13 000 r/min(r=8 cm)高速離心5 min，上清液按順序倒入移植預處理管，置于急診樣品架上機立即測定，30 min后測試結果自動傳送至中文處理系統。Cyclosporine測定加200 μl全血樣品于1.5 ml離心管，然后加入100 μl全血溶解劑，再加400 μl環保霉素全血沉淀劑，充分渦旋混勻，13 000 r/min高速離心5 min，上清液按順序倒入移植預處理管，置于急診樣品架上機立即測定，30 min后測試結果自動傳送至中文處理系統。

1.3.3 臨床樣本分組 根據Architect i2000對普樂可復檢測體系的檢測結果，將普樂可復濃度小于3.0 μg/L的16例樣本設置為低濃度組；在3.0～<14.0 μg/L之間的43例樣本設置為中濃度組；大于14.0 μg/L的19例樣本設置為高濃度組。根據Architect i2000對環孢霉素檢測體系的檢測結果，將環孢霉素濃度小于80.0 μg/L的9例樣本設置為低濃度組；在80.0～<300 μg/L之間的32例樣本設置為中濃度組；大于300 μg/L的11例樣本設置為高濃度組。

1.4 統計學處理

根據Architect i2000與SYVA Viva-E對普樂可復和環孢霉素的檢測結果，應用SPSS 13.0統計軟件。計量資料采用均數±標準差(x±s)表示，同種藥物2種方法檢測結果采用配對t檢驗，相關性采用直線回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種方法檢測78例次患者樣本tacrolimus結果

2種方法的檢測結果比較見表1。由表1可知，在低濃度組CMIA法檢測tacrolimus水平顯著低于EMIT法(P<0.05)，而在中濃度和高濃度組CMIA法檢測tacrolimus水平雖低于EMIT法，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 2種方法檢測52例次患者樣本cyclosporine結果

2種方法檢測結果比較見表2。低、中、高2濃度組的52例次患者樣本cyclosporine檢測結果，CMIA法均低于EMIT法，且差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 2種方法檢測78例次患者樣本tacrolimus結果比較(x±s)

注：CMIA：化學發光微粒子免疫分析技術，EMIT：酶增強免疫法

表2 2種方法檢測52例次患者樣本cyclosporine結果比較(x±s)

注：CMIA：化學發光微粒子免疫分析技術，EMIT：酶增強免疫法

2.3 比對結果

分別對78例次普樂可復和52例次環孢霉素樣本檢測結果進行方法學比對及回歸分析，2種方法檢測tacrolimus結果的相關性r=0.982(P<0.05)；檢測cyclosporine結果的相關性r=0.976(P<0.05)，均具有顯著的相關性。

3 討論

3.1 普樂可復和環孢霉素濃度監測的重要性

普樂可復和環孢霉素是2種高效免疫抑制藥，臨床上廣泛應用于預防器官移植的排斥反應和自身免疫性疾病的治療[5]。2種藥物在藥動學和藥效學上又存在著明顯的個體差異，且都具有治療的窗口范圍較窄、藥物之間具有復雜的相互作用、給藥劑量與血藥濃度具有顯著的相關性不佳等特點。因此，臨床必須不斷根據患者體內藥物監測結果適時調整用藥劑量，真正實施個體化給藥，這樣對減少移植物排斥反應發生的頻次、減少免疫抑制劑的不良反應及改善移植物長期生存率具有非常重要的臨床意義[6-7]。

3.2 EMIT和CMIA法的測定原理

用于生物樣本內普樂可復和環孢霉素2種免疫抑制劑的定量分析法，主要有免疫分析和色譜分析，其中免疫分析主要包括放射受體分析法、放射免疫法、熒光偏振免疫分析、ELISA法、EMIT法、化學發光法(CL)和CMIA等[8-9]。色譜分析目前主要有液相色譜和氣相色譜。不同的方法對樣本提取的過程不同，對代謝物的識別亦不同，因此所得的結果也不相同。CMIA測定原理是用吖啶脂標記藥物分子作為競爭物，用相應普樂可復或環孢霉素單克隆抗體包被的順磁微珠作為捕獲物，將處理完的樣品與包被的單克隆抗體的順磁微珠混合反應，然后加入吖啶脂標記的相應藥物分子，共同競爭磁微珠上的藥物抗體空位，然后外加磁場使磁微珠分離，清洗后加入預激發液與激發液試劑產生化學發光反應，化學發光的強度與樣品中的藥物濃度成反比，根據標準曲線，即可求得樣品中普樂可復或環孢霉素的濃度。而SYVA Viva-E是根據抗原抗體結合后酶活性的多少計算藥物濃度。SYVA Viva-E的檢測原理是將樣本中被測藥物與酶試劑中標記有重組酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(rG6PDH)的藥物競爭，活性(游離)的rG6PDH將抗體試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，致使動態吸光度改變，計算出其濃度。

3.3 2種檢測體系的結果分析

實驗結果表明，CMIA藥物濃度測定操作系統的智能化自動化程度高[10]，普樂可復和環孢霉檢測的精密度分別為0.3 μg/L和4.7 μg/L，檢測范圍分別為0～30 μg/L和0～1 500 μg/L，線性范圍分別為0.9～30 μg/L和11.7～1 500 μg/L。而EMIT法檢測血普樂可復和環孢霉檢測的精密度分別為0.6 μg/L和10.6 μg/L，檢測范圍分別為0～30 μg/L和0～1 000 μg/L，線性范圍分別為2.0～30 μg/L和40～1 000 μg/L，2者之間有顯著差異。在對ARCHITECT i2000系統檢測2種血藥濃度初步評價和分析性能驗證[11]的基礎上，我們進行了該項比對實驗及相關性分析。表1和表2顯示2種檢測方法檢測對該2種藥物濃度的檢測結果都有差異，CMIA 在檢測普樂可復濃度時結果低于 EMIT法，在低濃度時有顯著差異，而在中濃度和高濃度時雖有降低但差異無統計學意義，CMIA在檢測環孢霉素時3組均低于EMIT法，且有顯著差異，但2種方法具有較高的相關性。其CMIA法檢測普樂可復和環孢霉素的結果低于EMIT法，可能與其代謝產物的交叉反應率要比EMIT 低有關，其抗體特異性比EMIT要高，所以CMIA系統測試結果普遍低于EMIT系統測試結果，即系統偏差。由此可以看出，方法學的不同及與代謝產物發生交叉反應的非特異性是產生偏倚的主要原因[12]。多項研究表明，CMIA試劑盒在檢測全血普樂可復和環孢霉素濃度時，有非常好的效果[10-13]。

3.4 臨床使用性及推廣應用

雖然色譜分析的結果較為準確，但臨床難以推廣。ARCHITECT i2000檢測系統是近年來發展起來的一種高靈敏度的檢測方法，至于其檢測結果與EMIT 法檢測結果的相關性如何，是我們要提供給臨床醫師調整用藥的關健參考依據。基于以上分析及本檢測結果，我們認為可以選擇CMIA法和EMIT法進行普樂可復和環孢霉素治療藥物的檢測。因其自動化程度高、樣本用量少，樣本預處理簡單、快速，測定結果與臨床符合程度較好，并且適用急診和大樣本分析測定等優點，現國內應用較多。因2種方法的檢測結果存在偏倚，故臨床醫師對2種方法的檢測結果之間不應直接比較，并且各個實驗室得到的結果也可能會存在差異，這可能給臨床醫師的治療帶來一定的困惑[14]。所以作者認為，由于臨床狀態的復雜性，建議患者連續使用同一種檢測方法，或者是連續在同一個實驗室檢測，醫師應根據患者情況及臨床經驗確立患者的血藥濃度范圍，以便合理有效地調整該2種免疫抑制劑用量，避免或減少排斥反應和藥物不良反應的發生[14-15]。

[1] Djebli N，Rousseau A，Hoizey G，et al． Cyclosporine pop-ulation harmacokinetic / pharmacogenetic analysis andBayesian modelling in kidney transplant recipient[J]．Clin pharmacokinet，2010，45(11)：1135-1148．

[2] Benkali K，Prémaud A，Picard N，et al． Tacrolimuspopulation harmacokinetic - pharmacogenetic analysisand Bayesian estimation in renal transplant recipients[J]． Clin pharmacokinet，2009，48(8)：805-816．DOI:10.2165/11318080-000000000-00000.

[3] 沈燕，嚴春寅，丁翔，等． 腎移植術后普樂可復應用的臨床研究[J]．蘇州大學學報( 醫學版) ，2010，30(3)：560-562．DOI:10.1111/j.1365-2125.2008.03251.x.

[4] Mathew BS，Fleming DH，Jeyaseelan V，et al． Alimitedsampling strategy for tacrolimus in renal transplant pa-tients[J]． Br J Clin Pharmacol，2008，66( 4) : 467-472．

[5] 田野，解澤林，唐雅望，等． 腎移植術后免疫抑制劑的合理應用[J]． 中國醫學科學院學報，2009，31(3)：256-258．

[6] 張培環.化學發光微粒子免疫分析與熒光偏振免疫分析檢測環孢霉素血藥濃度比較[J]． 實用醫藥雜志，2012，29(5)：424-425．DOI:10.3969/j.issn.1671-4008.2012.05.029.

[7] 張善堂，唐麗琴，聶松柳． 免疫抑制劑的治療藥物監測研究進展[J]． 中國臨床保健雜志，2012，15(4)：433-436．DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.044.

[8] Mu Y, Zhang J, Zhang S, et al.Traditional Chinese medicines wu-wei-zi(Schisandra chinensis)and gan-cao(Glycyrrhiza ura-lensis Fisch)activatepregnane X recptor and increase warfarin clearance in rats[J].J Pharmacol ExpTher,2006;316:1369-1377.DOI:10.1124/jpet.105.094342.

[9] 沈景芬. 環孢素A血藥濃度監測方法的研究進展[J]．安徽醫藥，2009,13(1):83-85.DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2009.01.044.

[10] 馮艷青，劉振紅，張楊麗，等.三種他克莫司測定試劑盒測定移植病人全血中他克莫司濃度的比較[J]．中國衛生檢驗雜志，2012,22(8):1993-1996.

[11] 畢波，呂元． 定量檢測系統的方法學性能驗證實驗結果的評價[J]．中華檢驗醫學雜志，2007，30(12)：1332-1334．DOI:10.3760/j.issn:1009-9158.2007.12.003.

[12] 張弋，付鵬，鄭虹． 普樂可復在151例肝移植受者的常規檢測的群體藥動學研究[J]．中國藥學雜志，2008，43(24)：1897-1902．

[13] 袁明生． 化學發光微粒子免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體的應用評價[J]． 檢驗醫學，2010，25(7): 571-572．

[14] 姬懷雪.他克莫司血藥濃度監測注意事項與用藥指導[J]．中國現代醫藥雜志，2011,13(10):112-113.DOI:10.3969/j.issn.1672-9463.2011.10.053.

[15] 逄曉云，沈金芳.植物藥對他克莫司血藥濃度的影響[J]．中國臨床藥理學與治療學，2009,14.

Comparison and analysis of two different detection methods for blood concentration levels of immunosuppressant

WangLujun

(TraditionalChineseMedicineHospital,LingchengDistrict,DezhouCity,Dezhou253500,China)

ObjectiveTo investigate the sensitivity of chemoluminescent micro-particle immunoassay (CMIA) and enzyme multiplied immunoassay (EMIT) for the detection of blood drug concentration levels of tacrolimus and cyclosporine, and analyze the relationship between the CMIA and EMIT methods.MethodsIn accordance with measuring items, the 2 immunosuppressant agents were detected simultaneously by EMIT and CMIA. EMIT method was used as a detection standard for pairt-test and correlation analysis.ResultsThe correlation between the 2 detection methods for tacrolimus wasr=0.982 (P<0.05), and the deviation of the detected results was -0.71 μg/L (95% confidential interval: -0.91～-0.50μg/L), and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them (P<0.05). The correlation between the 2 detection methods for cyclosporine wasr=0.976 (P<0.05), and the deviation of the detected results was 0.57μg/L(95% confidential interval: 0.37～0.77μg/L), and statistical significance could also be found, when comparisons were made between them (P<0.05).ConclusionCMIA and EMIT could all be used for the detection of these 2 immunosuppressant agents, and there was good correlation between these 2 detection methods. However, their own range of therapeutic window should be established for the patients, when CMIA was used.

Tacrolimus; Cyclosporine; Chemoluminescent micro-particle immunoassay; Enzyme multiplied immunoassay

R446.1

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.06.021

253500 山東 德州，德州市陵城區中醫院

2017-09-28)

(本文編輯：彭潤松)