虎杖白藜蘆醇對(duì)人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞增殖及凋亡的影響

胡旻 桑雅清

虎杖白藜蘆醇對(duì)人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞增殖及凋亡的影響

胡旻 桑雅清

目的觀(guān)察虎杖白藜蘆醇對(duì)人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法以0、25、50、100、200μmol/L白藜蘆醇作用人結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理HCT-15細(xì)胞0、12、24、48、72h。采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)HCT-15細(xì)胞增殖的影響，倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布以及細(xì)胞凋亡率，免疫印跡方法以及聚合酶鏈反應(yīng)法觀(guān)察主要的細(xì)胞周期蛋白以及基因的表達(dá)情況。結(jié)果虎杖白藜蘆醇能顯著抑制HCT-15細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)時(shí)間-濃度依賴(lài)性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示隨著藥物濃度升高，細(xì)胞明顯皺縮。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，其中0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇處理24h后分別為（42.81±1.21）%、（49.25±0.92）%、（54.67±1.03）%、（64.24±1.17）%，50μmol/L白藜蘆醇作用0、24、48、72h后分別為（32.41±1.09）%，（48.35±1.03）%，（55.61±1.33）%，（70.24±1.43）%，各組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇組S期細(xì)胞比例隨著濃度增大而減小，分別為（34.89±0.66）%、（31.07±1.75）%，（28.66±1.71）%，（23.65±0.62）%，各組數(shù)據(jù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫印跡法檢測(cè)顯示，白藜蘆醇以時(shí)間依賴(lài)方式下調(diào)周期蛋白cyclin D1表達(dá)，上調(diào)p21cip1蛋白以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白剪切行Caspase-3和PRAP表達(dá)。結(jié)論白藜蘆醇能明顯抑制HCT-15細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，可引起HCT-15細(xì)胞的S期阻滯。

人結(jié)腸癌；HCT-15細(xì)胞；虎杖；白藜蘆醇；細(xì)胞周期；凋亡

目前臨床治療結(jié)腸癌主要通過(guò)手術(shù)切除[1]。中藥虎杖為蓼科（polygonaceae）植物虎杖（polygonum cuspidatum sieb.et zucc.）的干燥根莖，性味微苦寒，歸肝、膽、肺經(jīng)。虎杖的傳統(tǒng)用途主要治療關(guān)節(jié)痹痛、濕熱黃疸、癓瘕、咳嗽痰多、跌打損傷、癰腫瘡毒[2]。國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)虎杖的保肝護(hù)肝、心血管保護(hù)、降血糖、血脂以及抑制腫瘤生長(zhǎng)作用做了廣泛研究[3]，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮主要藥效作用的成分為白藜蘆醇[2]。白藜蘆醇（resveratrol）是一種多元酚類(lèi)化合物，在體內(nèi)外具有良好的抗腫瘤活性[4]。本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)技術(shù)研究白藜蘆醇抗結(jié)直腸腺癌作用機(jī)制，為臨床使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)HCT-15細(xì)胞(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))用含10%胎牛血清、青-鏈霉素（各100U/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥品白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，儲(chǔ)存濃度為100mmol/L。細(xì)胞周期試劑盒以及MTT試劑盒購(gòu)自合肥博美。實(shí)驗(yàn)用抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種到6cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右時(shí)，分別用不同濃度的白藜蘆醇（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）處理細(xì)胞24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理0、12、24、48、72h后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞按照7×103個(gè)接種于96孔板的每孔中，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。分別用不同濃度的白藜蘆醇（0、25、50、100、200μmol/L）處理24h以及50μmol/L白藜蘆醇處理0、12、24、48、72h后，每孔加入20μL MTT試劑孵育4h后，用150μL DMSO溶解，用酶標(biāo)儀讀出OD值并計(jì)算細(xì)胞增殖情況。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)取不同濃度的白藜蘆醇處理的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液研磨15min，用BCA法測(cè)量蛋白濃度。各組不同處理的樣品分別取30μg用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別室溫孵育一抗2h后，PBST洗脫30min，孵育二抗。用ECL發(fā)光法顯色曝光，膠片用掃描儀掃描分析。

1.6 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡用0、50、100、200μmol/L白藜蘆醇處理細(xì)胞24h后，或50μmol/L白藜蘆醇處理0、24、48、72h后收集HCT-15細(xì)胞，用70%乙醇固定4℃過(guò)夜，按通用型細(xì)胞周期試劑盒上的說(shuō)明，用PI/RNase A混合液37℃孵育20min。上機(jī)分析細(xì)胞周期的分布情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度RSV對(duì)HCT-15細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況顯示，細(xì)胞存活率與RSV的濃度呈現(xiàn)劑量的負(fù)相關(guān)性。0、25、50、100、200μmol/L的RSV處理24h后，HCT-15細(xì)胞的存活率分別為100%、81%、58%、36%和19%；50μmol/L白藜蘆醇作用不同時(shí)間后細(xì)胞存活率分別為100%、75%、52%、40%和22%（見(jiàn)封二圖1）。進(jìn)一步計(jì)算顯示RSV對(duì)HCT-15細(xì)胞在24h的半數(shù)抑制濃度（IC50）大約為60μmol/L。

2.2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)HCT-15細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察顯示，HCT-15細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生明顯改變，隨著RSV的濃度增加，細(xì)胞數(shù)量減少且逐漸變得扁平皺縮，細(xì)胞外形變得狹長(zhǎng)且細(xì)胞間隙增大（見(jiàn)封二圖2）。

2.3 不同濃度白藜蘆醇對(duì)HCT-15細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期和G2/M期細(xì)胞顯著減少，各組結(jié)果之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖3（封二）。

2.4 白藜蘆醇處理后對(duì)HCT-15細(xì)胞相關(guān)周期蛋白凋亡的影響免疫印跡法檢測(cè)表明，不同濃度的白藜蘆醇作用24h以及50μmol/L的白藜蘆醇處理細(xì)胞不同時(shí)間后，白藜蘆醇以濃度以及時(shí)間依賴(lài)方式下調(diào)cyclin D1表達(dá)，上調(diào)p21cip1表達(dá)。同時(shí)觀(guān)察到凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)以及BCL-2下調(diào)，剪切型PARP和Caspase-3明顯增強(qiáng)（見(jiàn)封二圖4）。

3 討論

白藜蘆醇廣泛存在于多種天然食物或藥物中，例如紅酒或者虎杖等。研究[5-8]表明，白藜蘆醇以劑量或者時(shí)間依賴(lài)性抑制多種不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞增殖，但其確切的抗腫瘤機(jī)制尚不清楚?？赡芘c誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[7]，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6]、抑制細(xì)胞DNA合成[5]、影響相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路活性[4，8]等有關(guān)。

表1 不同濃度白藜蘆醇處理24h及50μmol/L白藜蘆醇作用不同時(shí)間的細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)（%±s）

表1 不同濃度白藜蘆醇處理24h及50μmol/L白藜蘆醇作用不同時(shí)間的細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)（%±s）

注：與0μmol/L或0h比較，*P＜0.05；與50μmol/L或24h比較，△P＜0.05；與100μmol/L或48h比較，▲P＜0.05

?

本研究顯示，不同濃度的白藜蘆醇處理不同的時(shí)間對(duì)HCT-15細(xì)胞的增殖均有抑制作用，且白藜蘆醇對(duì)HCT-15細(xì)胞體外增殖抑制表現(xiàn)為時(shí)效和量效關(guān)系，白藜蘆醇可以阻滯細(xì)胞周期停留在G0/G1期。結(jié)果說(shuō)明白藜蘆醇將HCT-15細(xì)胞的周期停留在G0/G1期而減少細(xì)胞進(jìn)入S期轉(zhuǎn)換，這進(jìn)一步解釋白藜蘆醇能夠體外抑制細(xì)胞增殖。已有實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇抑制食管癌細(xì)胞周期從而阻止細(xì)胞由G0/G1向S期轉(zhuǎn)化[7，9]，然而也有實(shí)驗(yàn)表明，白藜蘆醇直接誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期從而抑制DNA的合成[10]，這些不同的研究結(jié)論可能與白藜蘆醇作用的條件以及細(xì)胞環(huán)境有關(guān)。因此關(guān)于白藜蘆醇作用于細(xì)胞周期將有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

白藜蘆醇對(duì)腫瘤的抑制作用除了與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)外，還與Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)因子有關(guān)[11-12]。研究表明，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax為促凋亡基因，二者相互作用對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用更依賴(lài)于Bax/Bcl-2比值[12]。Caspase-3被認(rèn)為是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)的最終因子，Caspase-3酶活性的增強(qiáng)代表凋亡的增加。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠顯著下調(diào)HCT-15細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)并且上調(diào)Bax表達(dá)，從而促進(jìn)Bax/Bcl-2比值升高，最終促進(jìn)剪切行Caspase-3蛋白表達(dá)。該過(guò)程代表了白藜蘆醇誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞凋亡重要的分子機(jī)制之一。

綜上所述，本研究表明，白藜蘆醇作用于HCT-15細(xì)胞后，導(dǎo)致p21CIP表達(dá)上調(diào)，cyclin D1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞將被阻滯于G0/G1期。同時(shí)白藜蘆醇誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比值的升高并且促進(jìn)剪切行Caspase-3升高最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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Effect of Resveratrol on the Cell Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer HCT-15 Cells

HU Min,SANG Yaqing.
Division of Chinese Medicine,the Central Hospital of Lishui,Lishui(323000),China

ObjectiveTo investigate the effect of resveratrol on the cellproliferation and apoptosis of human colon cancer HCT-15 cells.MethodsDifferent concentrations of resveratrol（25,50,100,200μmol/L）were used to treat human colon cancer HCT-15 cells,non-treatment cells served as control group.MTT assay was used to detect the effect of resveratrol on the HCT-15 cell proliferation.Morphological changes were observed under inverted phase contrast microscope.Flow cytometry was used to detect the cell cycle distribution and the percentage of apoptosis.Western blotting and polymerase chain reaction were used to observe the expression of major cell cycle proteins and genes expression.ResultsResveratrol treatment significantly inhibited the growth of HCT-15 cells in a time-and concentration-dependent manner.Cell morphology presented a shrinkage manner with the drug concentration increased.Flow cytometry showed that the percentage of G0/G1 phase in human colon cancer HCT-15 cells increased with the increasing of drug concentration for 24h（0μmol/L:42.81%±1.21%,50μmol/L:49.25%±0.92%,100μmol/L:54.67%±1.03%,200μmol/L:64.24%±1.17%）and that it also increased at the concentration of 50μmol/L resveratrol with the treatment time（0h:32.41%±1.09%,24h:48.35%±1.03%,48h:64.24%±1.17%,72h:70.24%±1.43%）,with statistically significant differences between control group and observation groups（allP＜0.05）.Resveratrol blocked the HCT-15 cells in the S phase also in a dose-dependent manner（0μmol/L:34.89%±0.66%,50μmol/L:31.07%±1.75%,100μmol/L:28.66%±1.71%,200μmol/L:23.65%±0.62%）,all with significant difference（P＜0.05）.The expression of cyclin D1 was down-regulated by resveratrol in a time-dependent manner,but the expression of cleaved caspase-3,PARP and p21cip1 proteins and genes were up-regulated.ConclusionResveratrol can inhibit the proliferation of HCT-15 cells and induce the cells to apoptosis by arresting the cells into S phase.

human colon cancer;HCT-15 cells;Polygonum cuspidatum;Resveratrol;cell cycle;apoptosis

浙江省麗水市中心醫(yī)院中藥房（麗水323000）

桑雅清，Tel：13567098114；E-mail：992436881@qq.com

（收稿：2017-04-20修回：2017-07-20）