青蒿素抑制CD133+HepG2細胞對γδ T細胞的耐受性及其機制研究

鄭璟瑤

青蒿素抑制CD133+HepG2細胞對γδ T細胞的耐受性及其機制研究

鄭璟瑤

目的探討青蒿素是否能抑制CD133+肝癌細胞HepG2對γδT細胞的耐受性及研究其機制。方法LDH釋放實驗檢測γδT細胞及青蒿素共培養對CD133+及CD133-HepG2的殺傷活性；Western blot實驗檢測γδT細胞及青蒿素共培養對CD133+HepG2細胞MCL-1表達水平、Caspase-9、Caspase-3活化水平和細胞色素C釋放水平的影響；流式細胞技術檢測γδT細胞及青蒿素共培養對CD133+HepG2細胞凋亡和線粒體膜電位的影響。結果LDH釋放實驗結果顯示，在相同數量γδT細胞處理下，CD133+HepG2細胞LDH釋放率顯著低于CD133-HepG2細胞，表明CD133+HepG2細胞對γδT細胞治療存在耐受性；同時，γδT細胞+青蒿素組CD133+HepG2的LDH釋放率顯著高于γδT細胞組和青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組[（55.3±6.1）%比（18.7±2.6）%、（24.2±2.8）%，P＜0.05]。流式細胞實驗結果顯示，γδT細胞+青蒿素組CD133+HepG2的凋亡率顯著高于γδT細胞組和青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組[（38.2±3.5）%比（10.5±1.1）%、（14.3±1.2）%，P＜0.05]。Western blot實驗結果顯示，青蒿素處理能顯著抑制CD133+HepG2細胞MCL-1蛋白表達水平。流式細胞實驗結果顯示，γδT細胞+青蒿素組CD133+HepG2相對線粒體膜電位顯著高于γδT細胞組和青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組[（0.21±0.02）比（0.78±0.05）、（0.71±0.05），P＜0.05]。Western blot實驗結果則顯示，γδT細胞+青蒿素組CD133+HepG2的活化Caspase-9、Caspase-3及細胞色素C的釋放均顯著高于γδT細胞組和青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組。結論青蒿素可能通過抑制CD133+肝癌細胞MCL-1表達水平抑制其對γδT細胞的耐受性。

青蒿素；MCL-1；γδT細胞；CD133；HepG2

肝癌患者的預后很差且5年生存率低[1]。手術和肝移植是目前最有效的治療肝癌手段，很大部分患者在確診時腫瘤往往已經進入中晚期，因此，化療或免疫治療是不可缺少的治療手段[2-3]。研究發現，一些腫瘤細胞，特別是CD133+腫瘤細胞對化療或免疫治療有很強的耐受性[4]，因此采取輔助治療手段降低CD133+肝癌細胞對化療或免疫治療的耐受性具有十分重要的意義。本研究目的在于探討青蒿素是否能抑制CD133+肝癌細胞HepG2對γδT細胞的耐受性及研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料Annexin V細胞凋亡試劑盒（批號APOAF）和青蒿素購于美國Sigma-Aldrich。線粒體膜電位染料JC-1（5，5，6，6-tetrachloro-1，1，3，3-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide）、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒（批號C0016）和線粒體分離試劑盒（批號C3601）購于江蘇碧云天生物技術有限公司。RPMI-1640培養基購于美國Gibco。溴代醇磷酸（BrHPP）購于法國Innate Pharma。白細胞介素2購于美國R&D System公司。髓樣細胞白血病-1（MCL-1）、活化半胱天冬酶-9（活化Caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（活化Caspase-3）、細胞色素C和β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Cell Signaling。pcDNA3.1質粒和脂質體2000購于美國Invitrogen公司。增強化學發光（ECL）試劑盒（批號32106）購于美國Pierce。異硫氰酸熒光素標記的CD133（CD133-FITC）熒光抗體購于美國BD公司。

1.2 細胞培養HepG2細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。按文獻所述將HepG2細胞用CD133-FITC熒光抗體和流式細胞分選儀對其中的CD133+及CD133-細胞進行分群[5]。分選后的細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，培養環境為37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。γδT細胞的培養按文獻所述[6]，取15例健康人的全血采取密度梯度離心法獲取單個核細胞并培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，加入3μmol/L γδT細胞特異性擴增劑溴代醇磷酸和400IU/mL的白細胞介素2培養14天。

1.3 MCL-1過表達質粒構建和轉染將人MCL-1基因的開放閱讀框架序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成MCL-1重組過表達質粒。MCL-1過表達質粒用脂質體2000按試劑操作說明書步驟進行轉染，簡要步驟如下：將2μg/mL質粒用脂質體2000進行包裹后將其加入到無血清培養基進行混合。將貼壁的HepG2細胞置于該無血清培養基孵育6h，之后棄去無血清培養基并加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養24h。

1.4 乳酸脫氫酶釋放實驗檢測CD133+及CD133-HepG2細胞對γδT細胞的敏感性按不同的E:T（效應γδT細胞個數：目標CD133+或CD133-HepG2靶細胞個數）將靶細胞和γδT細胞分別接種在transwell上室（0.4μM孔徑）和下室中進行共培養，12h后用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒按說明書步驟檢測CD133+及CD133-HepG2靶細胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放率。

1.5 乳酸脫氫酶釋放實驗檢測青蒿素是否影響CD133+HepG2細胞對γδT細胞的敏感性實驗分為對照組、青蒿素組、γδT細胞組、青蒿素+γδT細胞組及青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組。對照組為CD133+HepG2細胞單獨培養24h；青蒿素組為CD133+HepG2細胞加入10μmol/mL青蒿素處理24h；γδT細胞組為CD133+HepG2細胞與10倍CD133+HepG2數目的γδT細胞（E∶T＝10∶1）共培養24h；青蒿素+γδT細胞組為CD133+HepG2細胞與10μmol/mL青蒿素及2.5倍CD133+HepG2數目的γδT細胞共培養24h；青蒿素+γδT細胞+MCL-1質粒組為轉染MCL-1質粒的CD133+HepG2細胞與10μmol/mL青蒿素及2.5倍CD133+HepG2數目的γδT細胞共培養24h。細胞處理完畢后用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒按說明書步驟檢測CD133+HepG2細胞LDH的釋放率。

1.6 線粒體分離將CD133+HepG2細胞按上述進行分組。用線粒體分離試劑盒按試劑說明書步驟將處理后的CD133+HepG2細胞的線粒體從細胞質中分離出來，取無線粒體的細胞質進行后續的Western blot實驗，檢測其中細胞色素C的釋放水平。

1.7 Western blot實驗將CD133+HepG2細胞按上述進行分組。細胞處理完畢后提取其中的總蛋白質。將等量的總蛋白質用12%丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用MCL-1、活化Caspase-9、活化Caspase-3、細胞色素C和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.8 細胞凋亡和線粒體膜電位測定將CD133+HepG2細胞按上述進行分組。收集細胞后用凋亡檢測試劑盒按照說明書步驟檢測CD133+HepG2細胞的凋亡，Annexin V陽性細胞所占比例即為細胞凋亡率；用JC-1試劑按照說明書步驟檢測CD133+HepG2細胞的線粒體膜電位，相對線粒體膜電位為實驗組的紅色熒光強度與對照組紅色熒光強度的比值[7]。

2 結果

2.1 CD133+HepG2細胞對γδT細胞的耐受性將γδT細胞和CD133+或CD133-HepG2細胞按不同的E:T進行共培養后檢測腫瘤細胞LDH的釋放率。結果顯示，在γδT細胞的共培養下，CD133+HepG2細胞的LDH釋放率顯著低于CD133-HepG2細胞（見圖1），表明CD133+HepG2細胞對γδT細胞有耐受性。

圖1 CD133+和CD133-HepG2細胞與γδT細胞共培養后LDH釋放率

2.2 青蒿素通過抑制MCL-1表達抑制CD133+HepG2細胞對γδT細胞的耐受性Western blot結果顯示，CD133+HepG2細胞MCL-1表達水平顯著高于CD133-HepG2細胞（見圖2），提示MCL-1高表達可能是CD133+HepG2細胞對γδT細胞有耐受性的機制。LDH釋放實驗和凋亡檢測實驗結果顯示，γδT細胞+青蒿素組CD133+HepG2的LDH釋放率和細胞凋亡率顯著高于γδT細胞組和青蒿素組（見表1），提示青蒿素能抑制CD133+HepG2細胞對γδT細胞的耐受性。同時，轉染MCL-1表達質粒后，青蒿素和γδT細胞聯合處理后的CD133+HepG2細胞的LDH釋放率和細胞凋亡率明顯降低（見表1），表明青蒿素通過抑制MCL-1表達抑制CD133+HepG2細胞對γδT細胞的耐受性。

圖2 CD133+與CD133-HepG2細胞MCL-1表達水平

表1 各組LDH釋放率、細胞凋亡率比較（%±s）

表1 各組LDH釋放率、細胞凋亡率比較（%±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與γδT細胞組比較，▲P＜0.05；與青蒿素組比較，△P＜0.05；與γδT細胞+青蒿素組比較，□P＜0.05

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2.3 青蒿素促進CD133+HepG2細胞發生γδT細胞依賴的線粒體途徑凋亡流式細胞結果顯示，青蒿素能顯著促進γδT細胞對CD133+HepG2細胞線粒體膜電位的損傷，而轉染MCL-1質粒則能明顯抑制線粒體膜電位的下降（見表2），表明青蒿素能通過抑制MCL-1的表達促進CD133+HepG2細胞發生γδT細胞依賴的線粒體膜電位的下降。另外，Western blot結果顯示，青蒿素能顯著促進γδT細胞對CD133+HepG2細胞線粒體中細胞色素C的釋放，從而誘導細胞發生Caspase-9和Caspase-3的活化，而MCL-1質粒則同樣能抑制細胞色素C的釋放和Caspases的活化（見圖3）。這些結果表明青蒿素能通過抑制MCL-1表達促進CD133+HepG2細胞發生γδT細胞依賴的線粒體途徑凋亡。

3 討論

γδT細胞是效應性T細胞的一個亞群，具有良好的抗腫瘤作用[8-9]。CD133是一種糖蛋白，表達于細胞表面，被認為是“干細胞樣”細胞的表面標志。在包括肝癌在內的一些腫瘤細胞中，CD133+細胞亞群也被稱為腫瘤干細胞[10-11]。研究[12]表明，CD133+腫瘤細胞對抗腫瘤治療有較強的抵抗能力，因此CD133+腫瘤細胞已經成為腫瘤治療的重要靶點。

表2 各組相對線粒體膜電值比較（±s）

表2 各組相對線粒體膜電值比較（±s）

注：與對照組比較*P＜0.05；與γδT細胞組比較，▲P＜0.05；與青蒿素組比較，△P＜0.05；與γδT細胞+青蒿素組比較，□P＜0.05

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圖3 青蒿素促進CD133+HepG2細胞發生γδT細胞依賴的細胞色素C釋放和Caspase-9，Caspase-3活化

近年研究表明，青蒿素有一定的抗腫瘤效應，如青蒿素能顯著抑制肺癌的發展和轉移，又能抑制膽囊癌的細胞周期并促進其發生凋亡[13-14]。本研究結果表明，CD133+肝癌細胞對γδT細胞治療有明顯的耐受性，然而青蒿素能顯著增強γδT細胞對CD133+HepG2肝癌細胞的殺傷活性，因此，青蒿素可能是良好的免疫治療輔助藥物。

MCL-1屬于Bcl-2抗凋亡蛋白家族，主要表達于線粒體外膜上。研究[15-18]表明，過表達的MCL-1能阻礙腫瘤細胞的凋亡途徑，抑制由藥物引起的腫瘤細胞線粒體的損傷，從而使細胞色素C等凋亡活性物質不能從線粒體中釋放到細胞質中，抑制下游Caspase-9和Caspase-3的活化，保護腫瘤細胞逃避凋亡途徑。因此腫瘤細胞的MCL-1往往會發生過度，且MCL-1的過表達程度與腫瘤細胞對抗腫瘤治療的敏感性呈負相關[19]。

本研究Western blot實驗結果發現，青蒿素能顯著下調CD133+肝癌細胞中MCL-1表達水平。當轉染MCL-1過表達質粒上調肝癌細胞中MCL-1的蛋白水平后，青蒿素聯合γδT細胞對CD133+肝癌細胞的殺傷活性受到明顯抑制，且線粒體途徑的凋亡通路受到明顯阻斷，證明青蒿素是通過降低肝癌組織MCL-1蛋白表達促進γδT細胞對CD133+肝癌細胞線粒體途徑凋亡的誘導，使CD133+肝癌細胞發生凋亡性死亡。

綜上所述，青蒿素能顯著提高CD133+肝癌細胞對免疫治療的敏感性，可能為腫瘤免疫治療提供更有效的策略和思路。

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Effect of Artemisinin on Reducing the Tolerance of CD133+HepG2 to γδT Cells and Its Related Mechanism

ZHENG Jingyao.
Clinical Testing Center,Branch Hospital of Zhejiang Hospital,Hangzhou(310000),China

ObjectiveTo investigate the effect of artemisinin on the tolerance of CD133+HepG2 to γδT cells and the underlying mechanism.MethodsCD133+HepG2 cells were co-cultured with artemisinin and γδT cells,then LDH release assays were performed to evaluate the cell viability,Western blot analysis was performed to evaluate the expression of MCL-1,activation of caspase-9,caspase-3 and release of cytochrome c in CD133+HepG2 cells,Flow cytometry analysis was performed to measure the apoptosis and mitochondrial membrane potential in CD133+HepG2 cells.ResultsResults of LDH release assays showed that under the treatment of equal amount of γδT cells,the release rate of LDH in CD133+HepG2 cells was significantly lower than that in the CD133-HepG2 cells,which indicating that CD133+HepG2 cells were tolerant to γδT cell treatment.Meanwhile,the LDH release rate in γδT cells+artemisinin group（55.3%±6.1%）was significantly higher than that in the γδT cell group（18.7%±2.6%,P＜0.05）and γδT cells+artemisinin+MCL-1 plasmid group（24.2%±2.8%,P＜0.05）.Flow cytometry analysis results showed that the apoptotic rate in γδT cells+artemisinin group（38.2%±3.5%）was significantly higher than that in the γδT cells group（10.5%±1.1%,P＜0.05）and γδT cells+artemisinin+MCL-1 plasmid group（14.3%±1.2%,P＜0.05）.Western blot assays showed that artemisinin downregulated the expression of MCL-1 in CD133+HepG2 cells.In addition,relative mitochondrial membranepotential in γδT cells+artemisinin group（0.21%±0.02%）was significantly lower than that in the γδT cells group（0.78%±0.05%,P＜0.05）and γδT cells+artemisinin+MCL-1 plasmid group（0.71%±0.05%,P＜0.05）.The activation of caspase-9,caspase 3,and release of cytochrome c in γδT cells+artemisinin group was significantly stronger than that in the γδT cells group and γδT cells+artemisinin+MCL-1 plasmid group.ConclusionArtemisinin suppressed the tolerance of CD133+liver cancer cells to γδT cells through the inhibition of MCL-1 expression.

浙江醫院分院檢驗科（杭州310000）

artemisinin;MCL-1;γδT cells;CD133;HepG2

（收稿：2017-06-04修回：2017-07-30）