MicroRNA-638在骨肉瘤中表達下調及對其細胞增殖的影響

， ， ，，，

(南華大學附屬第二醫院骨科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫學·

MicroRNA-638在骨肉瘤中表達下調及對其細胞增殖的影響

陳斌，符勇，夏雪，郭偉明，金浩成，王曉旭*

(南華大學附屬第二醫院骨科，湖南 衡陽 421001)

目的探討miR-638在人骨肉瘤(OS)細胞增殖行為中的影響。方法通過實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miRNA-638在人OS組織及癌旁組織、人OS細胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)和正常人成骨NHOst細胞株中的表達；用LipofectamineTM2000轉染miR-638模擬物或抑制物，細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)檢測轉染后的吸光光度值，平板克隆形成實驗檢測菌落數量。結果miR-638在各組細胞中均有表達；OS細胞株中miR-638的表達明顯下調(P<0.05)；高表達miR-638能抑制OS MG63和U2OS細胞的增殖(P<0.05)。結論miR-638高表達能抑制OS細胞的增殖。

骨肉瘤； MG63； U2OS； MicroRNA-638； 細胞增殖

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是兒童和青年中最常見的一種侵襲性骨腫瘤，最常見的原發部位為脛骨近端、肱骨近端及股骨遠端，大約60%的病例是10～20歲的青少年患者,占青少年腫瘤的6%[1]。在近幾十年來，人們雖然付出了大量努力來明確OS的致癌機制，但OS的生存率到達了一個瓶頸，晚期OS的預后依然很差。其增殖速度快、易轉移的特點，使得OS在臨床上的死亡率和致殘率都很高。

MicroRNA，簡寫為miRNA，又名微小RNA，是內源性的、短小的單鏈RNA分子，由19．25個核苷酸組成，不參與蛋白質的編碼，但調節基因的表達。因為miRNA與靶mRNA不完全互補配對，所以每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以共同調節同一靶基因，由此形成復雜的調控網絡，精細調控功能基因的表達。miRNA是腫瘤分子生物學研究領域的熱點,研究發現血清/血漿中存在上百種miRNA，在腫瘤的發生、發展和轉移過程中有舉足輕重的作用，尤其在腫瘤的診斷、治療及預后監測方面具有應用價值。Wang等[2]檢測了非小細胞肺癌SPC-A1細胞培養上清液中miR-638表達水平及細胞凋亡率以及裸鼠移植瘤模型后體內的血清miR-638表達水平。結果顯示血清miR-638水平與非小細胞肺癌患者的生存率是相關的，在臨床上miRNA-638水平可能被視為非小細胞肺癌預后的潛在獨立預測因子。但miR-638在人OS細胞增殖行為中的作用一直不明確，鑒于文獻報導miR-638對腫瘤的抑制作用，本實驗以miR-638為研究對象，觀察其在OS組織中的表達及對OS細胞系(MG63、U2OS)增殖的影響，為miRNA-638成為人OS新的有前景的治療靶點提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1組織與細胞收集中山大學腫瘤研究所2008年1月～2012年12月OS組織及癌旁組織標本64對，平均年齡21歲，其中男性42例，女性22例，收集后液氮冷凍。所有標本取得都獲得了家屬知情同意，且此項目經附屬醫院臨床研究倫理委員會批準。所有收集的標本符合OS診斷，即有典型臨床癥狀、體征、相應影像學表現及病理學形態，術前未經局部及全身治療。OS細胞株(MG63、U2OS、HOS、SaOS2)及永生化的正常骨組織細胞株NHOst購買于上海美軒公司。

1.2實驗試劑氯仿、異丙醇、無水乙醇、無酶水(用雙蒸水按1∶1 000的比例稀釋DEPC原液，振搖混勻，37 ℃過夜，高溫高壓使DEPC降解)、75%乙醇、RNAiso Reagent試劑盒(日本TaKaRa公司)、RT試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)、PBS緩沖溶液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養基、胎牛血清、miR-638 mimic、miR-638 inhibitor、mimic NC、inhibitors NC(上海吉瑪公司)、LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)。

1.3儀器設備高速冷凍離心機、各種量程移液器、吸頭、EP管、PCR管、NanoDrop 2000、超凈工作臺、PCR熱循環儀、Thermal Cycler Dice Real Time System II 、6孔板和96孔板、細胞計數板、細胞培養箱、超速離心機、生物安全柜、倒置顯微鏡、酶標儀、-80 ℃超低溫冰箱。

1.4實驗分組定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組織中miR-638相對表達量分組：實驗組為64組人骨肉瘤組織/人骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株；對照組為64組對應的非癌組織/永生化的正常骨細胞株NHOst。

細胞增殖檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)實驗分組：實驗組為分別轉染miRNA-638 mimic與miRNA-638 inhibitor的MG63、U2OS細胞株；陰性對照組為分別轉染mimic NC與inhibitor NC的MG63、U2OS細胞株。

平板克隆形成試驗分組：實驗組為轉染 miRNA-638 mimic的MG63、U2OS細胞株；陰性對照組未轉染的MG63、U2OS細胞株。

1.5人OS細胞的培養將標本于37 ℃ 水浴溶化呈懸液，于培養基內混勻,離心后棄上清,將細胞沉淀用1.0 mL培養基混勻加入裝有14.0 mL培養基質的75 cm2方瓶中，于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養。待細胞生長融合至80%～90%時開始傳代，繼續放置于飽和濕度37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，2～3天更換培養基，之后根據細胞生長情況繼續給予傳代。

1.6 qRT-PCR檢測各組織中miR-638的表達按RNAiso Reagent說明書分別提取實驗組與對照組的總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA質量和濃度。應用PrimeScript RT試劑盒進行反轉錄反應，反應在Applied Biosystems 2700熱循環儀上進行。按說明書操作，配置反應液的所有操作均在冰上進行。反應體系如表1。逆轉錄反應條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s,4 ℃(注：10 μL反應體系最多使用500 ng的Total RNA)。將反轉錄的cDNA樣品按照適當的比例稀釋后，應用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，在Thermal Cycler Dice Real Time System II 擴增儀上進行PCR反應，實驗流程按說明書進行，反應體系如表2。每個樣本設3個復孔，以U6為內參，反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環。根據PCR所得的CT值運用2-△△CT法計算miRNA-638的相對表達量。

表1 反轉錄合成cDNA反應體系

表2 反轉錄合成cDNA反應體系

1.7 CCK-8實驗及平板克隆形成實驗

1.7.1 細胞鋪板 以MG63細胞為例。取處于對數生長期且細胞匯合度約為80%的MG63細胞，去除培養基后，經胰蛋白酶溶液消化呈懸浮狀態時，終止消化并輕柔吹打使細胞全部脫壁。將細胞懸液置入10 mL PE管中，在37 ℃恒溫下，離心后去上清液，繼續加入培養液，輕柔吹吸使細胞懸浮。分別吸取10 μL細胞懸液加入相應細胞計數板，計算懸液濃度以及吸取3 000個細胞所需懸液體積。繼續輕柔吹吸離心管中懸液50次后，加入相應體積細胞懸液至96孔板的6組中，然后每孔添加培養液至150 μL，周圍孔取100 μL PBS溶液填充，鋪完后 “十字”搖勻。每次鋪4塊96孔板，分別用作24 h、48 h、72 h和96 h的CCK-8實驗，每隔48 h換液。U2OS細胞鋪板步驟同MG63細胞。

1.7.2 細胞轉染 轉染步驟參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。

1.7.3 CCK-8實驗 轉染完成后，在細胞箱中繼續培養。每24 h取一塊孔板，在每一孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h。在酶標儀中震動10 min，用490 nm波長測定OD值，以630 nm為參考波長。

1.7.4 平板克隆形成實驗 取培養于10%胎牛血清RPMI培養基中的對指數生長期的MG63、U2OS細胞以及轉染miR-638 mimic的MG63、U2OS細胞，分別制成每毫升200個細胞的細胞懸液。取MG63/MG63-mimic細胞系液2 mL,U2OS/U2OS-mimic細胞懸液取4 mL,分別接種于六孔板的每一個孔中，使細胞分散均勻。六孔板置于37 ℃ 、5% CO2的培養箱中培養2周。當培養皿中出現肉眼可見克隆時，終止培養。甲醇固定15 min后空氣干燥。用0.1%結晶紫進行染色20 min，倒置顯微鏡觀察超過30個細胞的菌落數。

1.8數據處理及統計學分析采用SPSS 19.0統計學軟件進行t檢驗分析,P<0.05為差異有統計學意義。基因相對表達量用2-△△CT法計算。

2 結 果

2.1 qRT-PCR實驗檢測骨肉瘤組織、癌旁組織、骨肉瘤細胞及正常人骨細胞中成熟的miR-638的表達水平qRT-PCR檢測了64組骨肉瘤組織中成熟的miR-638的表達水平。結果顯示與相應的非癌組織(對照組)相比有36組(56.25%)骨肉瘤組織中miR-638的表達是下調的(P<0.001,圖1)。

圖1 64組骨肉瘤及癌旁組織中成熟的miR-638的表達水平 與對照組比較，*：P<0.001

實時熒光定量聚合酶鏈反應技術分別檢測骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株和永生化的正常骨組織細胞株NHOst(對照組)中的miR-638的表達水平。結果顯示在骨肉瘤細胞株中miR-638的表達明顯下調(P<0.001，圖2)。

圖2 熒光定量PCR檢測骨肉瘤MG63、U2OS、HOS、SaOS2細胞株與人正常骨組織細胞株NHOst中miR-638的表達與對照組NHOst比較，*:P<0.001

2.2 CCK-8實驗檢測miR-638的高表達或低表達對骨肉瘤MG63及U2OS細胞的增殖能力的影響

結果顯示miR-638高表達能顯著降低MG63和U2OS細胞的增殖能力(P<0.05,見圖3)。抑制miR-638表達顯著促進了MG63和U2OS細胞的生長(P<0.05,圖4)。

2.3平板克隆實驗檢測高表達miR-638對骨肉瘤MG63及U2OS細胞的集落形成能力的影響結果顯示miR-638的高表達能抑制人骨肉瘤MG63及U2OS細胞的增殖功能(P<0.05,圖5、圖6)。

圖3 高表達miRNA-638抑制人OS MG63與U20S細胞增殖與對照組比較，*:P<0.05

圖4 抑制miR-638的表達促進人OS MG63與U20S細胞增殖與對照組比較，*:P<0.05

圖5 高表達骨肉瘤U2OS細胞中的miR-638會抑制其集落形成能力與對照組比較，*:P<0.05

圖6 高表達骨肉瘤MG63細胞中的miR-638會抑制其集落形成能力與對照組比較，*:P<0.05

3 討 論

研究表明，OS的病因極其復雜，同時還具有龐大基因組的不穩定性及高度異常的核型，多個染色體拷貝數的增加或者丟失會使得OS中多條染色體發生改變[3]。OS的治療包括手術、術前和術后的標準化療或放療，5年生存率為60%～70%；晚期診斷、轉移性及復發性的腫瘤患者生存率更低(20%)，而其中位生存期僅為23個月[4]。為了監測OS的發展、改善OS患者的預后，探索一種能用于OS早期診斷的更方便、微創的方式，尋找新的治療靶點成為OS診斷及治療上亟需解決的問題。

深入研究發現，許多miRNA都在細胞增殖、凋亡、分化、運動等過程中起著重要調控作用。自20年前發現他們以來，生物信息學研究已經確定了超過1 000種的miRNA可參與人類基因組中一半基因的調節，每個miRNA可能控制數百個人類基因的轉錄[5]。超過50%的miRNA基因位于染色體脆弱位點，它的缺失或擴增對人類癌癥有重要影響，提示miRNA直接參與腫瘤的發生過程[6]。2002年Calin等人發現 miRNA-15a和miRNA-16-1可能與慢性淋巴細胞白血病的發病密切相關[7]。這一重要發現公布以后，人們逐漸在大量的腫瘤細胞系和臨床腫瘤樣本中發現了異常表達的miRNA，隨后在動物模型實驗也證實了miRNA對腫瘤的發生、發展有著重要作用[8]。

Tan等[9]人的研究發現在乳腺癌進展中，miR-638 是最重要的因子之一，miR-638 強制性表達可顯著降低細胞增殖率及三陰乳腺癌細胞侵襲能力。在Ma的研究中[10]發現，大腸癌標本中的miR-638由于腫瘤分級不同而表達不同。miR-638 抑制 Sox2的表達，同時，miR-638表達水平與在人結直腸癌組織中 Sox2 m RNA 表達水平呈負相關，這些可以說明miR-638可以作為一種新的結直腸癌侵襲相關腫瘤抑制因子。

鑒于miR-638在前期研究中“抑癌基因”的作用，本實驗采用實時熒光定量PCR的方法檢測64組人OS組織及相應的非癌組織中成熟的miR-638的表達水平，結果顯示與相應的非癌組織相比有36組(56.25%)OS組織中miR-638的表達是下調的，推測miR-638的表達下調可能對人OS的發生發展有促進作用，而并不能說明miRNA-638的表達與OS患者的生存率有顯著相關性，同時miR-638的表達與性別、年齡，腫瘤的位置、大小、分期與分級也沒有顯著的聯系。在CCK-8實驗中，與相應的對照組相比，轉染miR-638 mimic的實驗組細胞增殖速度明顯減慢，而轉染miR-638 inhibitor的實驗組細胞增殖速度明顯加快。這與之前研究miRNA-638的“抑癌基因”作用一致。

值得提出的是，在轉染mimic與inhibitor的實驗組中，隨著實驗時間的推移,其增殖速度有一定的加快或減慢。主要考慮miR-638 mimic及inhibitor為瞬轉,其mimic及inhibitor隨著時間推移在細胞中逐漸降解，導致細胞增殖速度有一定變化。另外，CCK-8實驗作為檢測細胞存活與增殖的方法之一，其檢測原理同常規的MTT略有差異，試劑生成物具有高度水溶性，所以簡便了實驗步驟也提高了實驗的敏感性。有文獻比較過兩者的靈敏度和準確性，CCK-8法操作更簡便,靈敏度高,準確性和重復性更好,是一種優于MTT法的檢測細胞增殖活性的方法[11]。

本研究表明，在人OS組織中，miR-638呈低表達；miR-638的高表達顯著抑制人OS MG63及U2OS的細胞增殖，而下調miR-638的表達能顯著促進其增殖，為miRNA-638成為人OS新的有前景的治療靶點提供了一定的理論依據。但還需繼續進行體內荷瘤動物實驗，及進一步研究miR-638抑制人OS細胞增殖的作用機制，為基礎研究成果轉化為臨床生物治療打下基礎。

[1] Isakoff MS,Bielack SS,Meltzer P,et al.Osteosarcoma:current treatment and a collaborative pathway to success[J].J Clin Oncol,2015,33(27):3029-3035.

[2] Wang F,Lou JF,Cao Y,et al.miR-638 is a new biomarker for outcome prediction of non-small cell lung cancer patients receiving chemotherapy[J].Exp Mol Med,2015,47:e162.

[3] Mohseny A B,Szuhai K,Romeo S,et al.Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2[J].J Pathol,2009,219(3):294-305.

[4] Fagioli F,Aglietta M,Tienghi A,et al.High-dose chemotherapy in the treatment of relapsed osteosarcoma: an Italian sarcoma group study[J].J Clin Oncol,2002,20(8):2150-2156.

[5] Hammond SM.An overview of microRNAs[J].Adv Drug Deliv Rev,2015， 87:3-14.

[6] Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,et al.Human micro RNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(9):2999-3004.

[7] Calin GA,Dumitru CD,Shimizu M,et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(24):15524-15529.

[8] Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res,2004,64(11):3753-3756 .

[9] Tan X,Peng J,Fu Y,et al.miR-638 mediated regulation of BRCA1 affects DNA repair and sensitivity to UV and cisplatin in triple-negative breast cancer[J].Breast Cancer Res,2014,16(5):435.

[10] Ma K,Pan X,Fan P,et al.Loss of mi R-638 in vitro promotes cell invasion and a mesenchymal-like transition by influencing SOX2 expression in colorectal carcinoma cells[J].Mol Cancer,2014,13(1):118.

[11] 萬文婷,李寧,劉靜,等.CCK-8法與MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的比較研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(12):3046-3048.

EffectofMicroRNA-638expressionontheproliferationofhumanosteosarcomacells

CHEN Bin,FU Yong,XIA Xue,et al

(DepartmentofOrthopaedics，theSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveTo investigate the role of miR-638 in biological behavior of osteosarcoma cell.MethodsThe expression of miR-638 in osteosarcoma MG63 and U2OS cells was detected by RT-PCR.miRNA-638 mimics (inhibhors) were transfected into MG63 and U2OS by using LipofectamineTM2000 to upregulate(deregulate) the expression of miRNA-638.The absorbance value in 24 h,48 h,96 h and 72 h following the transfection was detected by CCK-8.And colony forming assay was used to detect colony counts over 30 cells after 2 weeks.ResultsMiR-638 expressed in each group.The expression of miR-638 was down regulated (P<0.001) in the 36 groups (56.25%) compared with the corresponding non cancerous tissues.Mir-638 expression can significantly reduce the MG63 and U2OS cells growth rate (P<0.05),on the contrary,the suppression of miR-638 expression significantly promoted the growth of cells of U2OS and MG63 (P<0.05).ConclusionsHigh expression of miR-638 significantly inhibits the proliferation of osteosarcoma cells.MiR-638 may become a new target for the early diagnosis and treatment of osteosarcoma.

osteosarcoma; MG63; U2OS; MicroRNA-638; cell proliferation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.04.004

2017-02-10；

2017-06-18

湖南省教育廳資助項目(15C1215).

*通訊作者，E-mail:wxx1024@163.com.

R738.1

A

蔣湘蓮)