內質網應激在肺動脈高壓病理生理過程中的作用

，,2*

(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078；2.心血管研究湖南省重點實驗室)

·講座與綜述·

內質網應激在肺動脈高壓病理生理過程中的作用

何芳1，胡長平1,2*

(1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078；2.心血管研究湖南省重點實驗室)

內質網腔內蛋白折疊平衡在維持細胞功能中發揮重要作用。多種刺激可破壞內質網腔內蛋白折疊平衡，引發內質網應激。內質網應激與肺動脈高壓(PH)發生發展關系密切。PH的主要病因是肺血管重構引起肺動脈腔隙狹窄，肺血管重構過程涉及肺動脈平滑肌細胞、肺動脈內皮細胞、炎癥細胞、循環免疫細胞等多種細胞的病理改變。本文主要闡述內質網應激對PH肺血管重構時血管細胞功能的影響，為理解PH肺血管重構機制及尋找新的PH治療藥物提供參考。

內質網應激； 肺動脈高壓； 肺血管重構； 肺動脈內皮細胞； 肺動脈平滑肌細胞; 單個核細胞

內質網是真核細胞中大部分蛋白合成、折疊、轉運的主要場所。在缺血缺氧、鈣平衡紊亂和炎癥等刺激下，細胞發生內質網功能紊亂，使未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網腔內蓄積，引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1]。近年研究發現ERS與肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)發生發展關系密切[2-5]。PH表現為靜息時平均肺動脈壓大于25 mmHg或運動時大于30 mmHg，肺血管阻力大于3 Wood單位[6]。多種誘導PH發生發展的因素如缺氧[3]、病毒感染[7]、骨形成蛋白受體II(bone morphogenetic protein receptor type II，BMPRII)基因突變[8]、炎癥[9]、NOTCH3基因突變[10]等都可誘導ERS發生。給予ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenly butyrate，4-PBA)、牛黃熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)可逆轉低氧或野百合堿誘導的PH[2-5]，因此調節ERS可能是防治PH的一種新策略。

PH的主要病因是肺血管重構導致肺動脈腔隙狹窄[11]。PH的病理特征包括肺動脈內膜/中膜肥厚、外膜增厚及叢狀病變，細胞水平上表現為重構的肺動脈中肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs)、肺動脈內皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)、成纖維細胞等異常增殖和重構的肺血管周圍炎癥免疫細胞浸潤[12-13]。研究表明，ERS與PASMCs、PAECs、炎癥免疫細胞的增殖、凋亡、炎癥等密切相關[14]。因此本文主要闡述PH時ERS在PASMCs、PAECs和炎癥免疫細胞病理改變中的作用。

1 內質網應激

ERS時未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網腔內蓄積，為了清除這些非正確折疊的蛋白從而恢復內質網穩態，細胞激活一系列的信號轉導途徑，增加分子伴侶表達、抑制蛋白翻譯、加速蛋白降解；如內質網穩態不能恢復，則啟動ERS相關的凋亡途徑促進細胞死亡，這些過程統稱為未折疊蛋白質反應(unfolded protein response，UPR)[15]。哺乳動物中跨內質網膜蛋白受體肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE-1)、蛋白激酶RNA樣內質網激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和活化轉錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)是感受ERS并啟動UPR的主要受體。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulating protein 78，GRP78)是ERS的主要標志蛋白，作為一種分子伴侶在UPR的啟動中發揮重要作用。在非ERS條件下，GRP78和ATF6、IRE-1、PERK結合，使ATF6、IRE-1、PERK處于非活化狀態。在ERS時，由于GRP78與未折疊蛋白具有更高的親和力，GRP78從IRE1、PERK、ATF6上解離轉而和未折疊蛋白結合，使ATF6、IRE-1、PERK通路被激活[16]。

在ERS早期，ATF6、IRE1、PERK與GRP78解離后活化并啟動下游信號分子，恢復細胞內質網穩態，從而促進細胞存活。ATF6與GRP78解離后轉移到高爾基體，被高爾基體上的S1P和S2P酶剪切，其中N-端(ATF6f)轉位到細胞核中，上調分子伴侶和ERS相關降解基因表達，增強蛋白折疊和降解能力。IRE1、PERK與GRP78解離后形成同源二聚體，并發生自身磷酸化而活化。IRE1活化后，激活自身內切核糖核酸酶剪切X盒結合蛋白1(X-box binding Protein 1，XBP1)mRNA，從而形成具有轉錄活性的XBP1s(spliced XBP1，XBP1s)。XBP1s進入細胞核后激活IRE1依賴的降解途徑(IRE1-dependent decay，RIDD)，促進蛋白降解，并上調蛋白折疊和轉運相關基因。而活化后的PERK可磷酸化其下游靶標真核起始因子α(eukaryotic Initiation Factor α，eIF2α)，降低細胞內大部分蛋白翻譯水平，但磷酸化的eIF2α同時可反常地增加活化轉錄因子4(activating transcription factor-4，ATF4)表達，增加蛋白的轉運能力，減輕內質網負荷[17-18]。

當刺激過強或刺激時間過長時，上述反應不足以恢復內質網穩態，細胞則啟動ERS相關凋亡途徑，促進損傷性的細胞死亡。ERS主要通過活化PERK-eIF2α-ATF4-CHOP(C/EBP homologous protein，CHOP)通路誘導細胞凋亡。CHOP通過抑制抗凋亡基因BCL-2表達誘導細胞凋亡，或通過與ATF4形成異二聚體，修復mRNA翻譯過程，導致細胞內蛋白合成增加、ATP缺乏最后細胞死亡。此外，IRE1通路亦在ERS誘導的凋亡中發揮重要作用。活化后的IRE1招募腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2)，激活凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase，ASK1)和磷酸化其下游靶基因JNK，從而誘導ERS相關凋亡(圖1)[17-18]。

圖1 未折疊蛋白反應相關通路

2 內質網應激在肺動脈高壓病理生理過程中的作用

研究發現，在低氧或野百合堿誘導的PH動物模型，給予ERS抑制劑4-PBA和TUDCA均可降低PH動物平均肺動脈壓，減輕血管重構和右心室肥厚[3-5]。4-PBA和TUDCA是常用的化學分子伴侶，可通過促進蛋白折疊、阻止蛋白聚合并恢復未折疊蛋白的運輸等抑制ERS[18]。Salubrinal是一個小分子化合物，通過抑制磷酸化eIF2α的去磷酸化過程抑制ERS。最近研究表明，給予大鼠Salubrinal可保護和部分逆轉低氧誘導的大鼠PH，表現為平均肺動脈壓、右心室收縮壓和右心室肥厚程度降低。同時，檢測低氧誘導的大鼠PH右心室ERS相關蛋白表達水平，發現Salubrinal可降低低氧誘導的GRP78、鈣網蛋白、caspase-12和CHOP活化，表明Salubrinal可降低低氧誘導的ERS信號通路活化[19]。以上結果表明抑制ERS可緩解或逆轉PH。但有趣的是，皮下埋植滲透泵給予大鼠促黑激素(intermedin，IMD)4周(6.5 μg/天)并同時低氧處理，IMD卻可通過活化ERS相關通路抑制低氧誘導的PH，表現為減輕低氧誘導的PH大鼠右心肥厚、降低肺動脈血管壁厚度和末端肺動脈肌化程度；IMD可上調肺組織和PASMCs中ERS主要標志蛋白GRP78、GRP94以及ERS特異性凋亡蛋白caspase-12的表達水平，從而抑制PASMCs增殖、促進PASMCs凋亡[20]。以上研究提示，ERS在PH病理生理過程中發揮重要作用。

2.1內質網應激介導肺動脈平滑肌細胞增殖、凋亡和炎癥PASMCs增殖凋亡失衡和炎癥是肺血管重構時中膜肥厚的主要原因[21]。研究表明，適度ERS可促進PASMCs異常增殖和抑制其凋亡，并使PASMCs炎癥因子(如：IL-6、TNF-α及MCP-1等)釋放增加，從而促進肺血管重構[5]。但刺激過強或刺激時間過長則可激活ERS相關凋亡蛋白如 caspase-12、CHOP等，促進PASMCs凋亡，抑制其增殖，從而延緩肺血管重構[20]。

Nogo-B是一種內質網結構調節蛋白，低氧可通過活化UPR通路分支ATF6上調Nogo-B表達，Nogo-B表達增加后破壞內質網-線粒體單元，使線粒體超極化，增加線粒體鈣離子水平，從而促進PASMCs增殖[22]。4-PBA和TUDCA可抑制ATF6活化，降低低氧誘導的線粒體鈣離子水平升高，從而抑制PASMCs增殖誘導其凋亡[3]。上述研究表明，UPR通路分支ATF6參與低氧誘導的PASMCs增殖。在低氧誘導小鼠PH時，肺組織中ATF6、IRE1和PERK及其下游分子如CHOP、PDI、XBP1s等表達均升高；低氧處理小鼠原代PASMCs 72 h可促進PASMCs增殖，同時這些ERS相關通路分子表達亦增加，而用ERS抑制劑4-PBA處理PASMCs后細胞增殖被抑制，提示IRE1和PERK通路同樣在PH病理過程中起重要作用[4]。

與ERS促進PASMCs增殖相反，ERS亦可促進PASMCs凋亡。大鼠原代PASMCs在IMD和低氧雙重處理下發生ERS，但ERS早期反應不足以恢復PASMCs的內質網平衡，細胞啟動ERS相關凋亡信號通路并招募促凋亡分子casepase-12，促進PASMCs凋亡，從而減輕肺血管重構[10]。

ERS亦可通過增加PASMCs炎癥反應促進PH肺血管重構。在野百合堿誘導的PH大鼠,肺動脈中ERS相關信號分子(ATF6、eIF2α、CHOP)和炎癥因子(IL-6、CCL-2及MCP-1等)表達增加；用ERS誘導劑衣霉素處理PASMCs，發現炎癥因子IL-6、IL-1b和IL-2等表達增加，而用ERS抑制劑Salubrinal處理則可減少PASMCs炎癥因子釋放[2]。內皮素-1(ET-1)是一種血管活性肽，在人、動物模型PH中均長期高水平表達。用ET-1處理大鼠原代PASMCs發現，ET-1可激活UPR下游信號通路分子ATF6、sXBP1和eIF2α等，使ATF6在細胞核內快速累積，并促進PASMCs促炎因子白介素、透明質酸等產生[23]。

2.2內質網應激介導肺動脈內皮功能紊亂PAECs功能紊亂是PH發生的起始環節，早在1970年代末期就發現在PH患者肺血管病變部位內皮細胞和低氧誘導的PH大鼠PAECs中內質網膨脹，提示ERS產生并參與PH時PAECs的功能調節[24-25]。生理條件下，內皮細胞分泌各種因子(如：NO、前列腺素、血栓調節蛋白等)以維持血管正常張力及內環境穩態。各種擾亂血管內穩態的因素(如：低氧、BMPRII、炎癥等)均可使PAECs發生ERS，功能受損，甚至導致細胞凋亡，從而促進PH肺血管重構[26-27]。

用吡咯野百合堿處理PAECs亦可誘導細胞內質網膨脹，并伴隨著IRE1α和p-eIF2α表達增加，但分子伴侶GRP78表達變化不明顯[28]。體內研究發現，Gata6基因敲除小鼠的PAECs中，ERS被激活；小鼠PAECs敲除Gata6基因可引起小鼠自發PH，聯合低氧則可導致嚴重PH，表現為平均肺動脈壓力增加和肺血管、右心室重構更加明顯[29]。對比正常小鼠肺組織，低氧處理的小鼠肺組織中BIP和CHOP表達上調，而Gata6基因敲除聯合低氧處理的小鼠肺組織中BIP和CHOP表達上調更明顯[29]。臨床研究發現，硬皮病引起的肺動脈高壓(Systemic Sclerosis-associated pulmonary arterial hypertension，SSc-PAH)患者PAECs中ERS標志蛋白BIP和CHOP表達顯著增加[26]。

在慢性低氧誘導的PH大鼠，肺組織Hochest/PI染色顯示肺組織中存在凋亡現象，凋亡主要發生在肺泡上皮細胞及PAECs中；肺組織中GRP78、GRP94和caspase-12表達增加，提示低氧通過誘導ERS相關凋亡分子caspase-12表達促進細胞凋亡[30]。

2.3內質網應激介導外周血單個核細胞增殖和炎癥反應外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞)和單核細胞。肺動脈血管周炎癥細胞(單核細胞)浸潤、免疫細胞(T細胞、B細胞)分泌趨化因子和細胞因子可促進肺血管重構[31-32]。

分離健康人、不伴有PH的局限硬皮病(lcSSc)患者和lcSSc-PH患者外周血中PBMCs并檢測ERS相關蛋白和炎癥因子表達，結果發現在不伴有PAH的lcSSc患者和lcSSc-PH患者PBMCs中BIP、ATF6、IL-6表達均升高，lcSSc-PH患者PBMCs中BIP、ATF6、IL-6表達水平更高，提示ERS/UPR與lcSSc-PH炎癥反應相關。而用ERS誘導劑毒胡蘿卜素處理PBMCs可增加PBMCs中炎癥因子IL-6、HSP和IFN表達，表明ERS反應促進lcSSc-PH炎癥反應[33]。

早期研究發現，HLA-B*35是與lcSSc患者PH發展危險性相關的等位基因，HLA-B*35可通過活化內皮細胞ERS相關通路，上調干擾素相關基因及其他炎癥基因(如IL-6)表達，表明HLA-B*35可能通過ERS和炎癥基因表達參與lcSSc-PH病理過程[34]。同樣，在PBMCs中用腺病毒過表達HLA-B*35，結果顯示HLA-B*35過表達的PBMCs中ERS相關蛋白BIP和DNAJB1以及炎癥因子IL-6和HMGB1表達均顯著上調，提示HLA-B*35可能通過激活ERS促進炎癥反應發生。此外，HLA-B*35過表達的PBMCs中細胞周期抑制蛋白(CDNK1A)和促凋亡基因(Bax，Gadd45)表達下調，導致PBMCs異常增殖。HLA-B*35可能通過ERS介導PBMCs增殖和炎癥反應[35]。

3 展 望

ERS是機體對于刺激的一種代償性保護機制，適度的ERS可保護細胞，而當刺激過強或刺激時間過長時，過度的ERS可觸發下游ERS相關凋亡通路，誘導細胞凋亡。ERS在PH肺血管重構的發生發展中發揮著重要作用，適度ERS可引起PAECs功能紊亂、PASMCs增殖和炎癥、PBMCs炎癥等。ERS抑制劑4-PBA、TUDCA和Salubrinal等可減輕或逆轉低氧、野百合堿或BMPRII突變誘導的PH，而IMD可激活ERS緩解低氧誘導的PH，因此如何用藥物適度抑制和誘發ERS，是ERS相關藥物用于治療PH的難點。對ERS在肺血管重構病理生理過程中的作用進行深入探討，有助于解決這一難點，并為PH預防和治療提供新思路。

[1] Minamino T,Kitakaze M.ER stress in cardiovascular disease [J].J Mol Cell Cardiol,2010,48(6):1105-1110.

[2] Yeager M,Nguyen C,Ivy D,et al.Activation of the unfolded protein response is associated with pulmonary hypertension [J].Pulm Circ,2012,2(2):229.

[3] Dromparis P,Paulin R,Stenson TH,et al.Attenuating endoplasmic reticulum stress as a novel therapeutic strategy in pulmonary hypertension [J].Circulation,2013,127(1):115-125.

[4] Wu Y,Adi D,Long M,et al.4-phenylbutyric acid induces protection against pulmonary arterial hypertension in rats [J].PLOS ONE,2016,11(6):e0157538.

[5] Koyama M,Furuhashi M,Ishimura S,et al.Reduction of endoplasmic reticulum stress by 4-phenylbutyric acid prevents the development of hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2014,306(9):H1314-323.

[6] McLaughlin VV,Archer SL,Badesch DB,et al.ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension [J].J Am Coll Cardiol,2009,53(17):1573-619.

[7] Voelkel NF,Cool CD,Flores S.From viral infection to pulmonary arterial hypertension:A role for viral proteins [J].AIDS,2008,22(Suppl.3):S49-S53.

[8] John A,Kizhakkedath P,Al-Gazali L,et al.Defective cellular trafficking of the bone morphogenetic protein receptor type II by mutations underlying familial pulmonary arterial hypertension [J].Gene,2015,561(1):148-156.

[9] Michelakis ED,Wilkins MR,Rabinovitch M.Emerging concepts and translational priorities in pulmonary arterial hypertension [J].Circulation,2008,118:1486 -495.

[10] Chida A,Shintani M,Matsushita Y,et al.Mutations of NOTCH3 in childhood pulmonary arterial hypertension [J].Mol Genet Genomic Med,2014,2(3):229-239.

[11] Lai YC,Potoka KC,Champion HC,et al.Pulmonary arterial hypertension:the clinical syndrome [J].Circ Res,2014,115(1):115-130.

[12] Stacher E,Graham BB,Hunt JM,et al.Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension [J].Am J Respir Crit Care Med,2012,186(3):261-272.

[13] Paulin R,Michelakis ED.The metabolic theory of pulmonary arterial hypertension [J].Circ Res,2014,115(1):148-164.

[14] 徐健,左祥榮,解衛平.內質網應激與肺動脈高壓 [J].江蘇醫藥,2015,41(1):74-77.

[15] Liu MQ,Chen Z,Chen LX.Endoplasmic reticulum stress:a novel mechanism and therapeutic target for cardiovascular diseases [J].Acta Pharmacol Sin,2016,37(4):425-443.

[16] Oakes SA,Papa FR.The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology [J].Annu Rev Pathol,2015,10:173-194.

[17] Wang M,Kaufman RJ.Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease [J].Nature,2016,529(7586):326-335.

[18] Hetz C.The unfolded protein response:controlling cell fate decisions under ER stress and beyond [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(2):89-102.

[19] He Y,Liu C,Li X,et al.Salubrinal attenuates right ventricular hypertrophy and dysfunction in hypoxic pulmonary hypertension of rats [J].Vascul Pharmacol,2016,87:190-198

[20] Lenna S,Farina AG,Martyanov V,et al.Intermedin modulates hypoxic pulmonary vascular remodeling by inhibiting pulmonary artery smooth muscle cell proliferation [J].Pulm Pharmacol Therapeut,2014,27(1):1-9.

[21] Shimoda LA,Laurie SS.Vascular remodeling in pulmonary hypertension [J].J Mol Med,2013,91(3):297-309.

[22] Sutendra G,Dromparis P,Wright P,et al.The role of Nogo and the mitochondria- endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension [J].Sci Transl Med,2011,3(88):88ra55.

[23] Yeager ME,Belchenko DD,Nguyen CM,et al.Endothelin-1,the unfolded protein response,and persistent inflammation [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2012,46(1):14-22.

[24] Smith P,Heath D.Ultrastructure of hypoxic hypertensive pulmonary vascular disease [J].J Pathol,1977,121(2):93-100.

[25] Smith P,Heath D.Electron microscopy of the plexiform lesion [J].Br J Dis Chest,1983,77(1):1-13.

[26] Lenna S,Han R,Trojanowska M.Endoplasmic reticulum stress and endothelial dysfunction [J].IUBMB Life,2014,66(8):530-537.

[27] Burton VJ,Ciuclan LI,Holmes AM,et al.Bone morphogenetic protein receptor II regulates pulmonary artery endothelial cell barrier function [J].Blood,2011,117(1):333-341.

[28] Mukhopadhyay S.Discordant regulatory changes in monocrotaline-induced megalocytosis of lung arterial endothelial and alveolar epithelial cells [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2006,290(6):L1216-1226.

[29] Ghatnekar A,Chrobak I,Reese C,et al.Endothelial GATA-6 deficiency promotes pulmonary arterial hypertension [J].Am J Pathol,2013,182(6):2391-2406.

[30] 范小芳,李文娟,陳兆琴,等.慢性低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織內質網應激介導的凋亡的變化[J].中國應用生理學雜志,2011,27(3):270-274.

[31] Cheadle C,Berger AE,Mathai SC,et al.Erythroid-specific transcriptional changes in PBMCs from pulmonary hypertension patients [J].PLoS ONE,2012,7(4):e34951.

[32] Hassoun PM.Inflammation,growth factors,and pulmonary vascular remodeling [J].J Am Coll Cardiol,2009,54(1):S10-S19.

[33] Lenna S,Farina AG,Martyanov V,et al.Increased expression of endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response genes in peripheral blood mononuclear cells from patients with limited cutaneous systemic sclerosis and pulmonary arterial hypertension [J].Arthritis Rheum,2013,65(5):1357-1366.

[34] Lenna S,Townsend DM,Tan FK,et al.HLA-B35 upregulates endothelin-1 and downregulates endothelial nitric oxide synthase via endoplasmic reticulum stress response in endothelial cells [J].J Immunol,2010,184(9):4654-4661.

[35] Lenna S,Assassi S,Farina GA,et al.The HLA-B*35 allele modulates ER stress,inflammation and proliferation in PBMCs from limited cutaneous systemic sclerosis patients [J].Arthritis Res Ther,2015,17(1):363.

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.002

2017-03-19；

2017-05-01

國家自然科學基金(91439105，81473209，81273512).

*通訊作者，E-mail：huchangping@csu.edu.cn.

R363

A

蔣湘蓮)