循環miR-4731-3p在肺癌患者血漿中的表達及臨床意義

，，， ，， ， ，， ，，，*，*

(1.南華大學附屬南華醫院腫瘤內科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院腫瘤研究所；3.張家界市人民醫院呼吸內科)

·臨床醫學·

循環miR-4731-3p在肺癌患者血漿中的表達及臨床意義

呂秀1,2，雷明盛3，賈鳳玲2，李賽1，張楚紅1，胡甜1，賀莎1，嚴漢興1，胡云2，陳榮如1，譚貽兮1，文美玲1*，左建宏1,2*

(1.南華大學附屬南華醫院腫瘤內科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院腫瘤研究所；3.張家界市人民醫院呼吸內科)

目的探討microRNA-4731-3p(miR-4731-3p)在肺癌血漿中的表達及其臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測40例肺癌患者和40例健康人(作為對照)血漿miR-4731-3p的表達水平，分析其與臨床病理參數和預后的相關性。繪制受試者工作特征曲線(ROC)，評價血漿miR-4731-3p表達水平對原發性肺癌的診斷價值。結果肺癌血漿中miR-4731-3p的表達水平(0.11±0.05)顯著高于健康人(0.05±0.03)(P<0.001)；miR-4731-3p表達水平與癌胚抗原(CEA)正相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、臨床分期、遠處轉移均無明顯相關性(P>0.05)。血漿miR-4731-3p在ROC曲線下面積(AUC)為0.835(95% CI =0.750～0.921)。當miR-4731-3p臨界值取0.048時，對肺癌診斷的靈敏度為0.950，特異度為0.575。Kaplan-Meier分析顯示肺癌血漿中miR-4731-3p低表達者生存時間明顯高于高表達組(P<0.05)。結論血漿miR-4731-3p在肺癌血漿中表達上調，可作為肺癌診斷及預后判斷的潛在分子標志物。`

肺癌； 微小RNA-4731-3p； 診斷； 預后

肺癌是世界上腫瘤致死的主要原因之一，全球每年死亡人數超過150萬[1]。由于缺乏早期的診斷方法，大多數肺癌被診斷時已是晚期，這是肺癌高死亡率的主要原因。盡管近年來針對肺癌的手術、 放化療、 分子靶向治療及生物治療等綜合治療取得了較大的進步，但肺癌的5年生存率仍低于15%[2]。因此，尋求一種為肺癌早期診斷及預后判斷的分子標志物是目前亟待解決的問題。而微小RNAs( microRNAs，miRNAs)的出現為準確早期診斷肺癌開辟了新的思路。

MiRNAs是近年來發現的一大類內源性非編碼單鏈小分子 RNAs，長度約20 ～25 nt。在動物尤其是人體中，絕大多數miRNAs與靶 mRNAs 的 3′端非翻譯區( 3′UTR) 通過部分互補配對結合以抑制靶 mRNAs 翻譯成蛋白質，在轉錄后水平調控靶基因的表達，進而在細胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發育，并參與包括腫瘤在內的多種疾病過程[3]。最近研究發現，血清/血漿中有大量穩定存在的miRNA，并且可作為肺癌的診斷標記物。Chen等報道使用10種血清miRNA聯合診斷NSCLC的敏感度和特異度分別達到93%和90%[4]。另外Wei等報道血漿miRNA-21可以作為NSCLC的診斷標記物，并且還發現血漿miRNA-21的表達水平與肺癌的TNM分期相關，在T3-T4患者血漿中miRNA-21的表達水平高于T1-T2患者，III期-IV期患者的表達水平高于I期-II期患者的表達水平。使用血漿miRNA-21診斷NSCLC的敏感度和特異度分別為76.2%和70%。此外，還發現在使用以鉑類藥物為基礎的化療患者中，達到部分緩解的患者血漿中miRNA-21的表達水平明顯低于達到穩定和進展患者的表達水平[5]。MiRNAs 作為一類新的分子靶標，有多項研究證實其與肺癌的發生、發展、轉移關系密切，可能在肺癌的診斷、治療及預后中發揮重要作用[6-7]。本項研究通過實時熒光定量 PCR (Quantificational Reverse Transciptase PCR，qRT-PCR) 方法檢測肺癌患者及正常健康人血漿中 miR-4731-3P 的表達差異，分析其與臨床病理參數之間的相關性，探討其對肺癌早期診斷及預后的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2013年12月至2015年12月入住南華大學附屬南華醫院的新入院未經治療的肺癌患者的血漿標本40例，均為病理學明確診斷為肺癌，其中男32例，女8例；年齡45～79歲，平均年齡(62.30±8.95)歲；按 WHO 2004年版肺癌病理學分類標準，組織病理類型為腺癌 15 例、 鱗癌 25 例。根據2009年國際抗癌聯盟(UICC)頒布的第七版肺癌TNM分期標準進行臨床分期[8-9]，Ⅰ期1例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期20例；吸煙18例，不吸煙22例；遠處轉移20例，非遠處轉移20例。40例正常對照組，其中男例27，女例13，平均年齡(57.85±11.48)歲，兩組年齡和性別無統計學差異(P>0.05)。

1.2主要試劑總RNA提取試劑：miRNeasy Serum/Plasma Kit、逆轉錄試劑：miScript II RT Kit 、定量PCR試劑：miScript SYBR Green PCR Kit 、miR-4731-3p引物、內參miR-39購于德國QIAGENE公司。

1.3方法

1.3.1 RNA的提取 總的RNA從200ul的血漿中提取，提取方法按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說明書操作。提取后的樣本用于cDNA的合成。樣本存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 cDNA的合成 使用miScript II RT Kit試劑盒。每20ul逆轉錄反應為一個反應體系，包括 RNA 3μL，5x miScript HiSpec Buffer 4μL，10x miScript Nucleics Mix 2μL，RNase-free water 9μL 和miScript Reverse Transcriptase Mix 2ul。反應條件：37 ℃ 60 min；95 ℃保溫 5min；-20 ℃保存備用。

1.3.3 MiR-4731-3p的檢查 實時熒光定量 PCR反應體系如下：2x QuantiTect?SYBR Green PCR Master Mix 5μL，miR-39 miScript Primer Assay 或 miR-4731-3p miScript Primer Assay 1μL，RNase-free water 1μL，cDNA 2μL，總體積10μL。反應條件為：預變性95 ℃ 15 min，然后進行40個循環：94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，然后70 ℃ 延伸30 s。每個標本均做3個復孔，取均值。在55～95 ℃繪制溶解曲線。反應結束后計算得出每個反應管循環閾值( Ct)。以miR-39作為內參，△CT=目的基因CT-內參CT；△△CT=待測樣品中目的基因△CT -參照樣品中目的基因△CT；按2-△△CT值進行目的基因相對定量。

2 結 果

2.1 MiR-4731-3p在肺癌血漿中的表達40例肺癌血漿中miR-4731-3p的相當于內參的表達量為(0.11 ± 0.05)，正常人血漿中miR-4731-3p的相當于內參的表達量為(0.05 ± 0.03)，肺癌血漿中miR-4731-3p表達水平明顯高于正常人 (P<0.001)。見圖1。

圖1 MiR-4731-3p在肺癌患者及健康對照組血漿中的表達Control:正常健康人

2.2 MiR-4731-3p基因與臨床因素之間關系根據miR-4731-3p在肺癌患者中的表達差異，miR-4731-3p與癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)明顯相關(P<0.05)。與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、腫瘤大小、臨床分期、遠處轉移無明顯相關性 (P>0.05)。具體見表 1。

2.3血漿miR-4731-3p表達水平對原發性肺癌的診斷價值ROC曲線見圖2。ROC曲線下面積(Area Under the ROC Curve，AUC)為0.835(95% CI=0.750～0.921)， 最佳截點為0.048，診斷靈敏度和特異度分別為0.950和0.575。

2.4 MiR-4731-3p與肺癌患者的預后關系在40例肺癌患者的隨訪中，失訪1例，按照miR-4731-3p平均表達水平(0.11 ± 0.05)，分為低表達組和高表達組。Kaplan-Meier 分析顯示miR-4731-3p低表達組和高表達組生存時間差異有顯著統計學意義(P<0.05),見圖3。

表1 MiR-4731-3p表達水平與肺癌臨床病理參數之間的關系

圖2 ROC曲線

圖3 MiR-4731-3p與肺癌患者總生存期的關系

3 討 論

miRNA是近年發現的長度約 21-25 核苷酸的小型非編碼 RNA，可與靶mRNA的3′ 非翻譯區( 3′ untranslated region，3′ UTR) 結合，促進靶mRNA的降解和(或)翻譯抑制而發揮負調控基因表達的作用[10]。MicroRNA參與了幾乎生命所有過程，如細胞增殖、分化、凋亡、代謝、血管生成等[11-13]。同時microRNA作為癌基因或抑癌基因調控與腫瘤增殖、凋亡、侵襲、轉移和耐藥等相關的多種靶基因的表達，在腫瘤的發生、發展過程中發揮著至關重要的作用[14-15]。通過檢測外周血或組織中的 microRNA 的表達水平可對肺癌的早期診斷、治療反應預測和預后判斷等提供重要依據。

近幾年來，關于循環miRNAs的研究越來越多，但目前尚未有miR-4731-3p與肺癌的相關性報道。本研究證實肺癌組miR-4731-3p表達明顯高于健康對照組。同時我們進一步對肺癌患者臨床病理參數和生存期分析發現，miR-4731-3p表達水平與癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)明顯相關，與腫瘤的總生存時間呈負相關。由此提示miR-4731-3p可作為肺癌預后判斷的一個新的標志物，而關于miR-4731-3p的診斷效能， miR-4731-3p相對表達量ROC曲線下面積為0.835，靈敏度為95.0%，特異度為57.5%。其中靈敏度高，有利于肺癌的早期篩查。但特異度低，這符合肺癌的檢查手段的現狀，可能需要聯合其他檢查方法來進一步提高肺癌的診斷。

綜上所述，本研究通過檢測肺癌血漿中miR-4731-3p的表達水平及其與肺癌臨床病理參數和預后之間的關系，發現血漿miR-4731-3p是一種非常有前景的肺癌診斷及預后判斷的生物標志物。然而，miR-4731-3p在肺癌的發生、發展中的具體機制及相關性還需深入研究。本實驗僅僅在血漿水平上驗證了兩者的相關性，而對于肺癌血漿中miR-4731-3p的生物學功能及其與預后之間的關系，以及miR-4731-3p參與肺癌發生發展的確切分子機制仍需要更大樣本和多中心臨床實驗來進一步研究。

[1] Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2] Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[3] Lin PY,Yu SL,Yang PC.MicroRNA in lung cancer[J].Br J Cancer,2010,103( 8):1144 -1148.

[4] Chen X,Hu Z,Wang W,et al.Identi cation of ten serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression pro le as novel non-invasive biomarkers for non-small cell lung cancer diagnosis[J].Int J Cancer,2012,130(7):1620-1628.

[5] Wei J,Gao W,Zhu CJ,et al.Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of non-small cell lung cancer[J].Chin J Cancer,2011,30(6):407-414.

[6] Kang SM,Lee HJ.MicroRNAs in human lung cancer[J].Exp Biol Med (Maywood),2014,239(11):1505-1513.

[7] Markou A,Liang Y,Lianidou E.Prognostic,therapeutic and diagnostic potential of microRNAs in non-small cell lung cancer[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(10):1591-1603.

[8] Vallières E,Shepherd FA,Crowley J,et al.The IASLC Lung Cancer Staging Project:Proposals Regarding the Relevance of TNM in the Pathologic Staging of Small Cell Lung Cancer in the Forthcoming (Seventh) Edition of the TNM Classification for Lung Cancer[J].J Thoracic Oncol,2009,4(9):1049-1059.

[9] Wang J,Wu N,Zheng QF,et al.Evaluation of the 7th edition of the TNM classification in patients with resected esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol,2014(48):18397-18403.

[10] Jeong HC.Clinical aspect of microRNA in lung cancer[J].Tuberc Respir Dis,2014,77(2):60-64.

[11] Hamam D,Ali D,Kassem M,et al.microRNAs as regulators of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Dev,2015,24(4):417-425.

[12] Huang X,Zuo J.Emerging roles of miR-210 and other non-coding RNAs in the hypoxic response[J].Acta Biochim Biophys Sin,2014,46(3):220-232.

[13] Mo J,Zhang D,Yang R.MicroRNA-195 regulates proliferation,migration,angiogenesis and autophagy of endothelial progenitor cells by targeting GABARAPL1[J].Biosci Rep,2016,36(5):e00396.

[14] MacDonagh L,Gray SG,Finn SP,et al.The emerging role of microRNAs in resistance to lung cancer treatments[J].Cancer Treat Rev,2015,41(2):160-169.

[15] Zuo J,Wen M,Lei M,et al.MiR-210 links hypoxia with cell proliferation regulation in human Laryngocarcinoma cancer[J].J Cell Biochem,2015,116(6):1039-1049.

ExpressionandclinicalsignificanceofmiR-4731-3pinplasmaofpatientswithlungcancer

LV Xiu,LEI Mingshen,JIA Fengling,et al

(TheAffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-4731-3p (miR-4731-3p) in the plasma of patients with lung cancer and to determine the correlation between miR-4731-3p level and clinical parameters.MethodsQuantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used to examine the plasma level of miR-4731-3p in 40 patients with lung cancer and 40 healthy persons (control).The correlation between the plasma miR-4731-3p level and clinicopathological features and prognosis were investigated.Receiver operating characteristic (ROC) curve were drawn to evaluate the diagnosis value of miR-4731-3p expression in plasma for lung cancer.ResultsThe plasma miR-4731-3p was significantly up-regulated in patients with lung cancer as compared with healthy subjects.The expression of miR-4731-3p was associated with carcino-embryonic antigen (CEA) (P<0.05),while it was not associated with gender,age,smoking,pathology type,tumor size,clinical stage and distant metastasis (P>0.05).The area under the ROC curve (AUC) according to the miR-4731-3p expression in plasma was 0.835(95% CI =0.750～0.921),when the critical value was 0.048.The sensitivity for lung cancer diagnosis and specific degrees were 0.950 and 0.575 respectively.The expression of miR-4731-3p was correlated with overall survival of lung cancer (P<0.05).ConclusionThe expression of miR-4731-3p is up-regulated in tumor,and it may be a potential biomarker for the diagnosis and prognosis evaluation of lung cancer.

lung cancer; MiR-4731-3p; diagnosis; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.010

2016-10-25；

2016-12-28

國家自然科學基金(81272960)，湖南省科技廳項目(2013WK2010)，人社部重點項目[2016]176號，省衛計委項目[B2014-171]，張家界市科技局項目[2015GK1128].

*通訊作者，E-Mail:1115910801 @ qq.com；E-Mail:632138414@qq.com.

R734.2

A

秦旭平)