小麥近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表達分析

苑 瑩，胡亞亞,2，李建嫄，楊文香，劉大群,3

(1．河北農業大學植物病理學系/河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心/國家北方山區農業工程技術研究中心,河北保定 071001； 2.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035； 3.中國農科院作物所，北京 100081)

小麥近等基因系TcLr19中TaABCF基因的克隆及表達分析

苑 瑩1，胡亞亞1,2，李建嫄1，楊文香1，劉大群1,3

(1．河北農業大學植物病理學系/河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心/國家北方山區農業工程技術研究中心,河北保定 071001； 2.河北省農林科學院糧油作物研究所，河北石家莊 050035； 3.中國農科院作物所，北京 100081)

為了挖掘新的抗小麥葉銹病基因，以被無毒小麥葉銹菌誘導的TcLr19為研究對象，通過cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術在TcLr19中克隆到抗病相關基因TaABCF，并對其進行表達分析。序列分析表明，TaABCF基因的DNA和cDNA序列長度分別為3 100 bp和1 885 bp，包含4個內含子和5個外顯子，含有兩個核苷酸結合域，具有WalkerA、WalkerB和WalkerC保守序列。系統發育分析表明，TaABCF基因與來自烏拉爾圖小麥的EMS53714.1基因親緣關系最近。實時熒光定量分析表明，TaABCF基因在小麥TcLr19與小麥葉銹菌FHPL非親和互作前期表達提高，而在感病小麥Thatcher與小麥葉銹菌FHPL的親和互作后期表達受抑制，且在脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理下的表達早于水楊酸(SA)處理，說明TaABCF基因參與小麥的抗葉銹反應，且對ABA和MeJA的響應要早于SA。

TaABCF；基因克隆；小麥葉銹病；表達分析；信號途徑

小麥葉銹病是小麥主要病害之一，分布最為廣泛，發生嚴重時可造成5%～15%或者更高的經濟產量損失[1]。近年來，小麥葉銹病在我國小麥主產區日趨嚴重，就目前而言，有效利用小麥抗葉銹基因和抗葉銹相關基因成為防治該病的途徑之一。

ABC轉運蛋白是一大類跨膜蛋白，廣泛存在于自然界生物體中[2]。由于植物中ABC轉運蛋白種類繁多、結構復雜、功能多樣，參與植物一切生命活動過程，從而引起人們的廣泛關注[3]。很多證據表明，PDR類ABC轉運蛋白參與植物防衛反應。其中，一些PDR類ABC轉運蛋白可以經病原物產生的激發子誘導而產生抗菌、抗毒素物質，也有一些對抗真菌成分和有毒物質進行轉運[4-8]。小麥中已經克隆的持久抗葉銹病基因 Lr34是一個ABCG轉運蛋白編碼基因，兼抗條銹病和白粉病[9]。尚 毅等[10]從小麥望水白穗組織cDNA中克隆出PDR型ABC轉運蛋白基因 TaPDR1，并證明 TaPDR1參與了植物對禾谷鐮刀菌的防御反應。

植物-病原體相互作用的關鍵組成部分之一是激素信號傳導。其中，水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脫落酸(abscisic acid,ABA)已被證明在植物-病原體相互作用中發揮重要作用[11-13]。來源于長穗偃麥草(Agropyronelongayum或Thinopyrumponticum)7Ag染色體上的小麥抗葉銹病基因 Lr19是一個具有應用潛力的抗葉銹病基因。本實驗室前期應用cDNA-AFLP技術從mRNA表達水平研究小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19和感病對照Thatcher與小麥葉銹菌FHPL互作時基因表達的差異，分離得到與水稻的多效耐藥調控蛋白類ABC轉運蛋白(PDR-type ABC transporter 9)編碼基因同源性達84%的片段[14]。由于ABC轉運蛋白的基因普遍存在于各種生物體內，而對其在植物抗病方面的研究較少，尤其是其關于小麥抗病的研究甚少。因此，本研究以TcLr19為研究對象，通過RACE技術獲得可能與抗病表達相關的ABC轉運蛋白基因TaABCF，利用生物信息學軟件分析TaABCF基因的特性，并通過實時熒光定量技術對該基因在葉銹菌以及激素ABA、SA、MeJA(茉莉酸甲酯)誘導下的表達特性進行分析，從而揭示TaABCF在小麥抗葉銹病中可能的作用，以及激素ABA、SA和MeJA對其表達的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

供試小麥材料為TcLr19(抗葉銹病近等基因系)、Thatcher(感病對照)和鄭州5389，供試小麥葉銹菌菌株為FHPL(對TcLr19表現低毒力，對Thatcher表現高毒力)，均由河北農業大學銹病研究室提供。

將TcLr19和Thatcher的種子按每盆15粒分別播種于直徑15 cm的花盆中，置于溫度18～25 ℃、光照10～14 h的溫室內培養。待幼苗長至一葉一心期，取一部分幼苗將葉銹菌菌株FHPL的夏孢子均勻接種在葉片上，接種后噴水霧保濕，置黑暗條件下14～16 h，然后繼續轉入溫室培養。同時，取剩余幼苗，分別用5 mmol·L-1SA、0.01 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1MeJA[15-17]溶液噴灑葉片表面直至溶液滴下，然后繼續轉入溫室培養。分別于接種或噴灑激素后 0 h、6 h、12 h、18 h、1 d、1.5 d、2 d、3 d、4 d、6 d、9 d 和12 d剪取葉片0.1 g，液氮速凍，-70 ℃儲藏備用。其中，小麥葉片接種或噴灑清水為對照。

1.2 引 物

對小麥葉銹菌侵染的TcLr19的cDNA文庫進行EST序列分析時，首次發現六倍體小麥ABCF基因的同源序列，以此同源片段為參考序列[14]，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit中的要求，應用Primer 5.0軟件，在其5′端設計反向特異引物RACE-TaABCF-5，在其3′端設計正向特異引物RACE-TaABCF-3。將TaABCF基因5′RACE和3′RACE的測序結果進行拼接，根據拼接的全長序列，在其開放閱讀框兩端設計全長引物TaABCF-F和TaABCF-R。同時，在其3′端設計特異性的實時熒光定量引物Y-TaABCF-F和Y-TaABCF-R。內參引物為GAPDH-F和GAPDH-R。各引物序列見表1。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

采用TaKaRa公司的植物總RNA提取試劑盒提取小麥葉片總RNA，提取方法見說明書。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)合成第一鏈cDNA。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 TaABCF基因的克隆

1.4.1TaABCF基因的RACE擴增

以小麥葉銹菌生理小種FHPL侵染的不同時間點小麥葉片總RNA為反轉錄模板。利用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)進行3′RACE和5′RACE cDNA的合成。PCR程序：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5次循環；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5次循環；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25次循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0將目的片段純化、回收，回收的PCR片段與pGEM-T Easy Vector載體(Promegra公司)連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞[天根生化科技(北京)有限公司]，通過識別藍白斑初步篩選陽性克隆，通過單酶EcoRⅠ雙切進一步鑒定陽性克隆(對照為PCR產物及未轉化質粒)，最后送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。酶切所用質粒用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(生工生物工程)進行提取。酶切產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4.2TaABCF基因cDNA和DNA全長的克隆

利用引物TaABCF-F和TaABCF-R，在小麥葉銹菌侵染的TcLr19的葉片cDNA和基因組DNA(CTAB法提取)中進行PCR擴增。反應體系為25 μL，包括1.0 μL cDNA或DNA(100 ng· μL-1)、0.5 μL TaABCF-F(10 μmol·L-1)、0.5 μL TaABCF-R(10 μmol·L-1)、0.5 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、2.5 μL 10×PCR Buffer、0.3 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U· μL-1)、19.7 μL ddH2O。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，35次循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。然后依次進行目的片段的回收純化、重組質粒的構建和轉化、質粒的提取、插入片段酶切檢測和測序，具體參照1.4.1。

1.5 生物信息學分析

利用NCBI網站的BLAST程序對所克隆基因進行相似性比對和同源性分析；利用DNAMAN 5.2.2對3′RACE和5′RACE序列進行拼接；利用NCBI中的ORF Finder查找基因序列中可能的開放閱讀框；利用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)和InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)對蛋白質特性進行分析；利用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)或TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對多肽跨膜區域進行預測，同時結合BLASTX結果，選取與目標基因同源性較高的氨基酸序列；利用MAGE 4.0軟件采用最大簡約法(maximum parsimony method)分析目標基因與其同源性較高基因的系統進化關系。

1.6 實時熒光定量PCR分析

提取小麥葉銹菌株FHPL、5 mmol·L-1SA、0.01 mmol·L-1ABA和0.1 mmol·L-1MeJA處理下各個時間點的RNA并反轉錄成cDNA，用LightCycler 96實時熒光定量PCR儀對TaABCF在不同處理下的表達情況進行分析。反應體系20 μL，包括2.0 μL cDNA、0.5 μL Y-TaABCF-F(10 μmol·L-1)、0.5 μL Y-TaABCF-R(10 μmol·L-1)、10 μL TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)、7 μL ddH2O。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，45次循環；95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。GAPDH為內參基因。3個生物學重復。反應結束，觀察融解曲線，確保反應產物是特異性擴增。根據檢測到的Ct值，按照2-ΔCt法，計算目的基因在不同時間點樣品中的相對表達量，并用SPSS軟件對該基因在不同處理下各時間點的表達量進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 TaABCF基因的RACE擴增結果

以小麥葉銹菌侵染的TcLr19的cDNA為模板，利用引物RACE-TaABCF-5和RACE-TaABCF-3進行RACE擴增后，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，3′RACE擴增產物約750 bp，5′RACE擴增產物約1 500 bp(圖1)。將擴增得到的片段切膠回收后，分別與pGEM-T Easy Vector連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α并篩選陽性克隆。陽性克隆測序結果表明，3′RACE產物長742 bp，含有28 bp的polyA尾，能夠找到特異引物TaABCF-3及UPM引物，5′端與靶序列的3′端有667 bp的重疊區，采用DNAMAN 5.2.2的Sequence Assembly程序對3′RACE測序結果與靶序列進行拼接得到1 504 bp的拼接序列，表明所克隆的片段正是靶序列的末端；5′RACE產物長1 460 bp，能夠找到特異引物TaABCF-5及UPM引物，3′端與靶序列的5′端有742 bp的重疊區，采用DNAMAN的Sequence Assembly程序對5′RACE測序結果與靶序列進行拼接得到2 165 bp的拼接序列，表明所克隆的片段正是靶序列的5′末端。將所得到的3′RACE和5′RACE序列用DNAMAN軟件進行拼接，最終得到一個長2 240 bp的拼接序列。

2.2 TaABCF基因全長cDNA和DNA的擴增結果

以小麥葉銹菌侵染的TcLr19葉片的cDNA和DNA為模板，利用引物TaABCF-F和TaABCF-R進行PCR擴增，擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現，cDNA中的擴增產物小于2 000 bp，DNA中的擴增產物大于2 000 bp(圖2)。經測序發現，TaABCF的cDNA長1 885 bp，DNA長3 100 bp，且測序結果和拼接序列一致。

M： DL2000；1： 3′RACE PCR產物; 2: 5′RACE PCR產物。

M： DL2000；C： cDNA的PCR產物；D: DNA的PCR產物。

圖3 TaABCF的基因結構

2.3 TaABCF基因的生物信息學分析

NCBI網站分析結果顯示，TaABCF基因含有5個外顯子和4個內含子(圖3)。ORF Finder預測結果顯示，TaABCF基因編碼區長1 779 bp(193～1971 bp)，編碼592個氨基酸。SMART軟件對TaABCF基因的結構域和功能位點分析表明，在92～294 aa和404～571 aa存在與ABCF轉運蛋白相同的保守核苷酸結合域(圖4)，因此，TaABCF基因屬于ABCF類，且發現TaABCF基因編碼產物具有WalkerA、WalkerB和WalkerC等保守氨基酸序列(圖5)。利用TMpred對跨膜結構域進行預測，結果顯示，TaABCF蛋白在212～235 aa處可能存在1個跨膜區(圖6)。利用MAGE 4.0對TaABCF基因編碼的蛋白產物進行了系統發育分析，結果(圖7)表明，TaABCF與來自烏拉爾圖小麥的EMS53714.1基因親緣關系最近，與二穗短柄草中的XP003573221.1基因和擬南芥中EMT20534.1基因的關系較近。

圖4 TaABCF基因的結構域

加粗序列代表起始密碼子和終止密碼子；灰色序列代表核苷酸結合域；下劃線處代表WalkerA、WalkerB、WalkerC結構域。

圖6 TaABCF蛋白的跨膜結構預測圖

Zm：玉米；Sb：高粱；Si：谷子；Et：畫眉草；Mn：桑樹；Gm：大豆；Ob：短花藥野生稻；Os：水稻；Bd：二穗短柄草；At：擬南芥Tu：烏拉爾圖小麥。

2.4 葉銹菌誘導下TaABCF基因的表達模式

在TcLr19與小麥葉銹菌非親和互作組合中，TaABCF基因在0～6 h緩慢上升，6 h后有所下降，12 h后持續上升，1.5 d時達到表達量的小高峰，之后表達量下降，6 d時達到表達量的最大值，然后再次下降(圖8)。差異顯著性分析結果表明，在18 h、1 d、1.5 d、3 d和6 d時，非親和互作中TaABCF基因的表達量極顯著高于清水對照(圖8)。在Thatcher與小麥葉銹菌親和互作組合中，TaABCF基因在0～12 h緩慢上升，12 h時達到表達量的小高峰，之后表達量變化不大，1.5 d后表達量下降，2 d后再次上升，6 d達到表達量的最大值，隨后表達量下降(圖8)。差異顯著性分析結果表明，在2 d、9 d和12 d時，親和互作中TaABCF基因的表達量極顯著低于清水對照(圖8)。綜上所述，非親和互作中TaABCF基因的表達在前期明顯提高，而親和互作中該基因的表達在后期明顯受到抑制。

2.5 信號分子誘導下TaABCF基因的表達模式

在0.01 mmol·L-1ABA處理下，TaABCF基因在0 ～12 h表達量上升，在12 h達到表達量的最大值，隨后下降，18 h再次上升，到1.5 d達到表達量的第二個高峰后再次下降，2 d時表達量再次上升，于4 d時達到表達量的第三次高峰，隨后急劇下降，在12 d時表達量再次升高(圖9)。差異顯著性分析結果表明，在12 h、18 h和1.5 d時，0.01 mmol·L-1ABA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達量極顯著的高于清水對照(圖9)。在0.1 mmol·L-1MeJA處理下，TaABCF基因在0～12 h表達量上升，在12 h達到表達量的第一個高峰，后急劇下降，18 h表達量再次上升，到1.5 d達到表達量的最大值，隨后下降，在3 d表達量開始緩慢上升。差異顯著性分析結果表明，在12 h和1.5 d時，0.1 mmol·L-1MeJA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達量極顯著的高于清水對照。在5 mmol·L-1SA處理下，TaABCF基因在0～6 h緩慢上升，6 h后有所下降，12 h后持續上升，1.5 d時達到表達量的最大值，之后表達量下降，4 d時達到表達量的第二高峰，然后再次下降，在12 d時表達量有所上升。差異顯著性分析結果表明，在18 h和1.5 d時，5 mmol·L-1SA處理下TcLr19中TaABCF基因的表達量極顯著的高于清水對照(圖8)。由圖中可以看出，三種激素均能誘導TaABCF基因的表達，且ABA和MeJA對TaABCF基因的誘導早于SA。

TcLr19+：TcLr19接種葉銹菌；TcLr19：TcLr19接種清水(對照);Tc+：Thatcher接種葉銹菌；Tc：Thatcher接種清水(對照)；**表示處理與對照差異在0.01水平上顯著。下同。

TcLr19 +：TcLr19 接種小麥葉銹菌；TcLr19 ABA：TcLr19經ABA處理；TcLr19 MeJA：TcLr19經MeJA處理；TcLr19 SA：TcLr19經SA處理。TcLr19：TcLr19接種清水(對照)。

3 討 論

在植物中，ABC轉運蛋白種類繁多、結構復雜、功能多樣，參與植物一切的生命活動過程，從而引起人們的廣泛關注[3]。植物ABC轉運蛋白不僅參與植物體內激素、脂質、金屬離子、次生代謝物和外源物質的運輸，而且有利于植物與病原體間的相互作用和植物體內離子通道的調控[18]，從而參與了植物的抗病過程[19]。比如，在廣泛的擬南芥突變體遺傳篩選中，AtABCG36/AtPDR8/PEN3首次被認為是侵染前的非宿主抗性的關鍵因素，對大麥白粉病病原體的敏感性增加[20]。 Lr34是目前唯一一個通過編碼ABCG轉運蛋白來抵抗病原物的侵染與擴展的基因。

ABCF亞族的基因包含兩個NBD結合域，沒有TMD結構域，該亞族在植物中的功能還沒有確定。對本研究中已克隆的TaABCF基因的結構域和功能位點的分析結果表明，該基因包含兩個NBD結合域，每個NBD結合域編碼產物具有WalkerA、WalkerB和WalkerC等保守氨基酸序列，因此推斷TaABCF基因編碼的蛋白屬于ABCF家族。目前，在小麥中尚未對ABCF類基因進行克隆，因此本研究中所克隆的TaABCF基因是小麥中新發現的基因。

通過實時熒光定量分析表明，TaABCF基因在非親和互作中從18 h開始極顯著性表達，在1.5 d、3 d和6 d同樣存在較高的表達量；而在親和互作中，從2 d開始TaABCF基因的表達量顯著性減少。由此可以表明,TaABCF參與了小麥的抗葉銹反應。

植物-病原體相互作用的難題中的關鍵組成部分之一是激素信號傳導[21-22]。病原菌誘導產生的信號通過精密復雜的傳導途徑逐級傳遞，最終激活防御反應基因或者增強防御反應基因的表達，從而使植株對病原菌表現出了抗性[23-24]。研究植物中對病原體防御起作用的激素中，最有主要的是SA、JA和ABA[25-29]。Kuromori等[30]研究表明，ABC轉運蛋白AtABCG25參與ABA的運輸和響應。而另一個全轉運子蛋白AtABCG40也被證明其有助于ABA穿過質膜進入氣孔[31]。在水稻轉錄組中分析顯示，ABCG成員中有近一半對JA和SA有積極反應[32]。本試驗研究表明，ABA和MeJA處理下0～12 h上升表達，到12 h開始極顯著性表達，而在SA處理下TaABCF基因從18 h開始極顯著性表達，說明TaABCF基因明顯受ABA、MeJA和SA的誘導，但是響應時間略有不同，對ABA和MeJA的響應要早于SA，可能ABA和MeJA對TaABCF基因的調控位于SA的上游，也因此使TaABCF基因在受到這三種信號分子誘導后有不同的表達模式。結合本實驗室的VIGS結果(未發表)可知，TaABCF基因確實參與了小麥的抗葉銹性過程。對于TaABCF基因作用的受體和影響TaABCF參與抗病性的機制有待于今后進行Co-IP深入研究。

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CloningandExpressionAnalysisofTaABCFinWheatNearIsogenicLineTcLr19

YUANYing1,HUYaya1,2,LIJianyuan1,YANGWenxiang1,LIUDaqun1,3
(1.Department of Plant Pathology,Agricultural University of Hebei/Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas,Baoding,Hebei071001，China; 2.Institute of Cereal and Oil Crops,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang,Hebei 050035，China; 3.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081，China)

In order to discover new genes against wheat leaf rust,this study was carried out to clone resistance related genesTaABCFby RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique from TcLr19 infected by a virulentPucciniatriticina,and its expression analysis was analysed. The full length cDNA and genomic DNA of theTaABCFgene are 1 885 bp and 3 100 bp,respectively.And it contains 4 introns and 5 exons,and has two nucleotide binding domains and each contains Walker A,Walker B and Walker C. The phylogenetic analyses showed thatTaABCFhas the closest relationship with EMS53714.1 gene fromTriticumurartuThum. ex Gandil. Expression analysis with real-time fluorescent quantitative PCR showed that the expression ofTaABCFwas improved in the incompatible interaction between TcLr19 andP.triticinaFHPL in the early stage,while inhibited in the compatible interaction between Thatcher and FHPL latterly. The expression ofTaABCFwere earlier when treated with ABA and MeJA than that of SA,which showed thatTaABCFgene is involved in the resistance of wheat leaf rust and it responds to ABA and MeJA earlier than SA.

TaABCF; Gene clone; Wheat leaf rust; Expression analysis; Signal pathway

時間：2017-12-11

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171211.1106.002.html

2017-06-14

2017-10-29

河北省自然科學基金項目(C2013204065)；河北省產業體系小麥產業創新團隊建設項目(HBCT2013010204)

E-mail:1126092776@qq.com(苑 瑩)；huyaya_002@126.com(胡亞亞，與第一作者同等貢獻)

楊文香(E-mail：wenxiangyang2003@163.com)；劉大群(E-mail：ldq@hebau.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)12-1525-09