松材線蟲和擬松材線蟲繁殖能力差異研究

徐紅梅+王義勛+王勇

摘要：松材線蟲作為外來入侵種，逐步取代擬松材線蟲占據生態位。初步研究表明這可能與兩種線蟲的繁殖能力差異關系密切。本研究采取了兩種方法，即離體條件競爭試驗和體內競爭試驗比較二者繁殖力。結果表明，松材線蟲的繁殖水平明顯高于擬松材線蟲。松材線蟲和擬松材線蟲混合物長時間培養后，松材線蟲逐步競爭淘汰擬松材線蟲。除此以外，離體培養和體內競爭結果均表明，競爭條件下松材線蟲的繁殖力高于非競爭條件。

關鍵詞：松材線蟲；擬松材線蟲；繁殖能力

中圖分類號：S732文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2017）05-0027-04Study on the Difference of Offspring Fecundity Between

Bursaphelenchus xylophilus and B.mucronatus Xu Hongmei（1）Wang Yixun（1）Wang Yong（2）

（1.Hubei Forestry AcademyWuhan430075；2.Yingshan County the stataowned forest form WujiashianHuanggang438700）

Abstract： As an alian species Bursaphelenchus xylophilus replaced B.mucronatus gradually.Prelimemary study suggested their fecundity difference was the reason behind. The fecundity of their offspring under competitive and noncompetitive condition was compared. B. xylophilus showed stronger fecundity than B.mucronatus. The mixture of B. xylophilus and B.mucronatus was cultured for a long time， B.xylophilus replaced B.mucronatus gradully.The fecundity of B. xylophilus under competitive condition was stronger than under noncompetitive condition.

Key words：Bursaphelenchus xylophilus；B.mucronatus；fecundity

外來入侵種對當地生物多樣性有嚴重的不良影響，尤其是對于生態系統中占據相同生態位的當地種。松材線蟲病在原產地北美地區并未對當地松林資源造成嚴重危害，但傳入日本、中國等亞洲國家后擴展蔓延迅速且形成了嚴重破壞[13]。擬松材線蟲原產地為歐亞地區，在北半球分布極其廣泛，包括：中國、芬蘭、法國、德國、日本、韓國、俄羅斯和瑞典。擬松材線蟲在許多地區并未對松林造成嚴重危害[4]。

黑松體內同時接種無致病力擬松材線蟲和致病性松材線蟲與單獨接種致病性松材線蟲相比，黑松枯萎速度和死亡率都降低，這表明土著種擬松材線蟲對外來種松材線蟲入侵有一定程度的抑制作用。但是隨著松材線蟲病不斷擴展，外來種松材線蟲逐步取代擬松材線蟲占據生態位優勢[5]。目前關于外來入侵種松材線蟲競爭取代本地土著種擬松材線蟲的機制仍然不清楚，初步研究表明可能與兩種線蟲的繁殖能力差異關系密切。

為了研究外來入侵種松材線蟲競爭取代本地姊妹種擬松材線蟲機制，本研究采取了兩種方法研究二者繁殖能力差異：離體條件競爭試驗，即在真菌培養基上共培養2種線蟲和單獨培養2種線蟲，然后比較二者繁殖能力；體內競爭試驗，2種線蟲共同接種到感病寄主上和單獨接種到感病寄主上比較二者繁殖能力。

1供試材料與方法

1.1供試線蟲來源

蟲株來源及編號見表1。各蟲株都經過形態學和特異引物擴增詳細鑒定，在分類上確認無誤。

1.3供試線蟲培養

超凈工作臺上用無菌鑷子將保存在冰箱的線蟲轉移至新鮮的PDA平板-灰葡萄孢上培養，3～5 d后待菌絲被線蟲取食完畢放置冰箱備用。將培養好的線蟲用無菌水洗出，在10×體視鏡下用移液槍挑取線蟲。

湖北林業科技第46卷第5期徐紅梅，等：松材線蟲和擬松材線蟲繁殖能力差異研究1.4線蟲數量檢測

無菌水洗出線蟲后，將線蟲液稀釋至10 mL，充分搖勻后用微量移液器吸取025 mL放置在凹玻片上，在顯微鏡下計數每個液滴中的線蟲數量，重復4次，根據平均值計算10 mL分離液線蟲的數量。

1.5離體條件競爭試驗

為了確定松材線蟲和擬松材線蟲在離體條件下的競爭力，在真菌培養基上共培養2種線蟲和單獨培養2種線蟲，然后比較二者繁殖能力。本研究采用中國馬鞍山松材線蟲（MASBx）和法國擬松材線蟲（FrBm）兩個蟲株開展試驗，每個培養組合重復5次。

1.5.1兩種線蟲混合培養

從培養好的線蟲液中挑取50頭松材線蟲與50頭擬松材線蟲（雌雄比為1∶1）放置在長滿灰葡萄孢的PDA培養基上，25 ℃下培養。10 d后，無菌水洗出各培養皿的線蟲，顯微鏡下檢查并計算出線蟲總數、雌蟲數量、雄蟲數量和幼蟲數量。

為了觀察松材線蟲和擬松材線蟲的種間競爭長期效果，對混合培養組合進行連續繼代培養。培養10 d后，用50 mL無菌水洗出每個培養皿中的線蟲得到線蟲懸浮液。懸浮液充分混勻后，用100 μL移液槍吸取50 μL線蟲懸浮液至新的灰葡萄孢平板上。10 d后重復以上步驟2次直至培養至4代（總共約40 d）。繼代培養過程中在顯微鏡下檢查并計算每一代線蟲總數、雌蟲數量、雄蟲數量和幼蟲數量。endprint

1.5.2兩種線蟲單獨培養

從培養好的線蟲液中挑取100頭松材線蟲與擬松材線蟲（雌雄比為1∶1）分別放置在長滿灰葡萄孢的PDA培養基上，25 ℃下培養。10 d后，無菌水洗出各培養皿的線蟲，顯微鏡下檢查并計算出線蟲總數、雌蟲數量、雄蟲數量和幼蟲數量。

1.6寄主體內競爭試驗

為了確定松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物體內的競爭力，將兩種線蟲單獨和混合接種到感病寄主植物體內觀察二者之間的競爭情況。本研究采用中國浙江松材線蟲（ZJBx）和中國擬松材線蟲（CBm）兩個蟲株開展試驗。感病寄主植物選用2年生馬尾松幼苗體。接種采用皮接法：用無菌解剖刀片在2 a生馬尾松苗莖中部一側切開長約05 cm的傷口，傷口深達木質部，在傷口處夾入一小團無菌脫脂棉球，用封口膜將馬尾松苗與脫脂棉包扎起來，封口膜外再用透明膠帶包成一個小漏斗，將線蟲懸浮液0.5 mL滴入脫脂棉，線蟲接種量約為3 000條·mL-1，每個處理接種5株，同時以蒸餾水為對照。在接種后的24 h內每隔3 h給脫脂棉滴加適量蒸餾水保濕。接種后，室內溫度保持25～30 ℃。觀察馬尾松幼苗的變化，大約20 d后，接種幼苗產生萎蔫癥狀后，將馬尾松苗從土中拔出，洗凈根部后將整株剪碎，用無菌水浸泡洗出線蟲，離心收集線蟲，顯微鏡下檢查線蟲分離情況，計數分離線蟲數量。

2結果與分析

2.1離體條件下線蟲繁殖力

松材線蟲和擬松材線蟲在真菌培養基上的繁殖數量見表1。總體來說，無論是單獨培養還是混合培養條件下，松材線蟲的繁殖數量都顯著大于擬松材線蟲。混合培養條件下，松材線蟲競爭優勢十分顯著，繁殖數量遠遠大于擬松材線蟲。隨著繁殖代數的增加，松材線蟲的競爭優勢逐步增強，混合培養物中，松材線蟲數量逐步增多，而擬松材線蟲數量逐步減少。

圖5為連續混合培養松材線蟲和擬松材線蟲40 d時，兩種線蟲繁殖總數對比圖。從中可以看出，隨著培養時間的增長，松材線蟲的繁殖數量逐步增加，而擬松材線蟲則相反，繁殖數量隨著混合培養時間的增長逐步遞減。從種群競爭角度來看，隨著共培養時間的增加，占據競爭優勢地位的松材線蟲數量逐步增加，而占據劣勢地位的擬松材線蟲數量逐步減少，直到松材線蟲占據了整個生態位。

2.2寄主植物中線蟲繁殖力

松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數量（見表2）。總體說來，松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數量都小于在真菌培養基上。對比松材線蟲和擬松材線蟲在寄主植物中的繁殖數量可以看出，單獨接種條件下擬松材線蟲繁殖數量稍微高于松材線蟲；混合接種條件下，松材線蟲繁殖數量遠大于擬松材線蟲。由此可以看出，擬松材線蟲作為土著種，在松樹寄主植物中的繁殖能力并不比外來種松材線蟲差；但是隨著外來種松材線蟲的入侵，擬松材線蟲的繁殖數量逐步減少，而松材線蟲的繁殖數量逐步增多。

3討論

本研究通過離體條件競爭試驗和體內競爭試驗比較競爭和非競爭條件下兩種線蟲的繁殖能力差異，結果表明，松材線蟲的繁殖水平高于擬松材線蟲。松材線蟲和擬松材線蟲混合物長時間培養后，松材線蟲逐步競爭淘汰擬松材線蟲。除此之外，室內培養和寄主接種結果均表明，競爭條件下松材線蟲的繁殖力高于非競爭條件。

參考文獻

[1]Khan F A，Gbadegesin R A.On the occurrence of nematode induecd pine wilt disease in Nigeria[J].Pakistan Journal of Nematology，1991（9）：5758.

[2]Mota M M，Braash H，Bravo M A，et a1.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999（l）：727734.

[3]葉建仁，黃麟.松材線蟲病病原學研究的幾個問題[J].中國森林病蟲，2012，31（5）：1321.

[4]Kulinich， O.， P.Orlinski.Distribution of conifer beetles （Scolitydae， Curculionidae， Cerambycidae）and wood nematodes （Bursaphenchus） species in the European and Asian Russia[J].EPPO Bulletin， 1998，28：3952.

[5]SiMi LIAO，Satomi KASUGA，Katsumi ToGASHI.Suppressive effects of Bursaphelechun mucronatus on pine wilt disease development and mortality of B.xylophilus-inoculated pine sdddlings[J].Nematology， 2011，13（6）：701712.

（責任編輯：夏劍萍）第46卷第5期endprint