慢性粒細胞白血病附加染色體異常分析

于波海,仁 實,張 萌,柴 淼,蘇麗菊,貢鐵軍,于 鑫,騰 旭

(1.哈爾濱醫科大學 生物學博士后流動站，黑龍江 哈爾濱150081；2.哈爾濱市第一醫院 檢驗科，黑龍江 哈爾濱150010；3.哈爾濱市第一醫院 血研所，黑龍江 哈爾濱150010；4.大連大學附屬中山醫院 醫學檢驗部，遼寧 大連116001)

慢性粒細胞白血病附加染色體異常分析

于波海1,2,仁 實3,張 萌2,柴 淼2,蘇麗菊2,貢鐵軍3,于 鑫4,騰 旭1*

(1.哈爾濱醫科大學 生物學博士后流動站，黑龍江 哈爾濱150081；2.哈爾濱市第一醫院 檢驗科，黑龍江 哈爾濱150010；3.哈爾濱市第一醫院 血研所，黑龍江 哈爾濱150010；4.大連大學附屬中山醫院 醫學檢驗部，遼寧 大連116001)

目的分析17例Ph1陽性慢性粒細胞白血病患者附加染色體異常克隆演變特征。方法采用常規染色體G顯帶技術，回顧性分析17例慢性粒細胞白血病患者遺傳學資料。結果219例Ph1陽性CML患者，17例附加染色體異常發生率7.8%，其中慢性期10例(6.8%)，加速期3例(7.7%)，急變期4例(11.8%)。結論在CML診斷、治療及進展過程中，傳統的染色體分析技術仍然是檢測ACAs的唯一方法，并提示可能的致病性、預后和療效。

慢性粒細胞白血病；附加染色體異常：核型分析

(ChinJLabDiagn,2017,21:2043)

慢性粒細胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML) 是一類起源于多功能造血干細胞的惡性克隆性疾病。其診斷特征是9號染色體平衡易位至22號染色體，形成t (9;22) (q34;q11. 2 )，即費城染色體(Philadelphia chromosome,Ph1)形成及BCR-ABL融合基因的產生[1]。根據其斷裂位點的不同可分為3種亞型：e13a2 (b2a2)、e14a2 (b3a2)和ela2，分別編碼 P210、P230和P190 蛋白，在白血病發生發展中起著極為重要的作用[2]。CML發生、發展過程存在三個階段：慢性期(chronic phase,CP) 、加速期(accelerated phase,AP) 以及急變期(blast crisis,BC) 。附加染色體異常(additional chromosome abnormalities,ACAs) 經常出現在CML的發生、發展各個階段以及急性變過程中。大約有8%的Ph1染色體陽性的初診CML病例可觀察到附加染色體異常[3]。本研究，將我單位近十年間17例附加染色體異常CML患者遺傳學結果分析匯報如下。

1 對象與方法

1.1 對象

2006-2016年間我院接受治療的CML患者241例，其中17例患者Ph1+伴附加染色體異常，男性13 例；女性6例；中位年齡43歲；經形態學、遺傳學、免疫學、分子生物學檢測，參照WHO(2001)標準診斷為CML并分期。臨床分期： 慢性期10 例；加速期3例；急變期4例。

1.2 方法

1.2.1染色體分析

全部病例均采集新鮮骨髓標本直接法或不加植物血凝素的短期培養法，制備染色體標本，然后采用姬姆薩G顯帶技術進行核型分析，全部病例均分析20-40個中期分裂相。參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》的有關規定，分析染色體變異情況，并進行照相、描述。

1.2.2BCR-ABL(P210)融合基因檢測

采集骨髓2 ml，肝素抗凝。將標本沿管壁加到 Ficoll 分離液上層，兩者比例為1∶1 2 000 r/ min，室溫離心 20 min，吸取中間單個核細胞層，取 1 滴細胞混懸液計數后，收集約 106個細胞沉淀，-80℃備用。按照 Trizol (TaKaRa，中國) 說明書抽提 RNA。應用7500型Q-PCR儀 (ABI，美國)。試劑來源于上海源奇生物醫藥科技有限公司的 BCR-ABL 融合基因定量檢測試劑盒(熒光 RT-PCR 法)，嚴格按試劑盒說明書操作。實驗中同時對 BCR-ABL P210參考品和內參基因參考品進行擴增，分別獨立分析， 用獲得的相應兩條標準曲線，分別得到各標本 BCR-ABL 的檢測濃度(A)和內參基因的檢測濃度(B)。BCR-ABL 水平 = (A/B)×100%。

2 結果

2006-2016年間我單位門診及住院CML患者241例納入本研究，經常規染色體G顯帶核型分析發現，219例患者Ph1染色體陽性，占 90.9% (219/241) ；17例Ph1染色體陽性患者伴有附加染色體異常，發生率7.8% (17/219)，男女比例11:6，中位年齡43 (21-65)歲；其中慢性期10例，加速期3例，急變期4例 (表1) 。

Ph1+伴ACAs可出現在CML各個階段，本研究中CML各階段ACAs發生率及主要核型異常見表2。

表1 17例Ph1+伴ACAs CML患者臨床特征

表2 CML各階段Ph1+伴ACAs發生率及主要核型異常

本研究應用熒光定量PCR技術，比較17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因表達水平，結果見表3。結果顯示，慢性期BCR-ABL水平顯著低于加速期與急變期。

表3 CML各階段Ph1+伴ACAs患者BCR-ABL(P210)融合基因表達水平

3 討論

自從1960年Ph1首次被報道以來，其機制正在被大量的細胞遺傳性研究結果所揭示。關于CML常規染色體分析報道非常普遍，但是有關Ph1+伴ACAs的報道尚少見。本研究報道17例Ph1+伴ACAs的CML患者染色體異常克隆演變特點。

ACAs與CML疾病進展密切相關，Ph1+伴ACAs意味著CML患者疾病侵襲性進展的加速，傳統的染色體分析技術在CML診斷、治療及進展中發揮的重要作用仍不能被分子生物學方法所替代。本研究中ACAs發生率隨著疾病的進展不斷增高，預示ACAs在疾病預后中的作用機制可能更加復雜。意大利成人血液病工作小組關于CML前瞻性實驗研究結果顯示，Ph1+伴ACAs在CML患者細胞生成和分子應答率明顯降低，且染色體異常的患者應答時間明顯延長，附加染色體異常是使用伊馬替尼作為一線治療的慢性粒細胞白血病患者的一個不良預后因素[4]。據報道，附加染色體為非隨機性的，存在主要途徑(major-route)及次要途徑(minor-route)；主要途徑如：雙Ph1、+8、+9、i17等；次要途徑如：t(3;12)、t t(4;6)、t(1;21)、-Y、-17/+17、+21等。主要途徑ACA提示預后較差，臨床需要密切觀察、及時治療；次要途徑ACA與經典的t(9;22) 預后未見明顯差異[5]。

近期研究結果顯示，雙Ph1、+8、+9、+19、+21、i17是ACA中常見的染色體異常，其中雙Ph1、+8及i17出現較為多見。+8、+9、+21易見于在髓系急性變 (myeloid-BC) 患者，而非淋系急性變 (lymphoid-BC) 患者；可能+8更具有急變趨勢的預測價值[6]。本研究中急變期患者僅4例，尚未觀察到這一現象，推測CML其它階段出現+8、+9、+21與急變期CML進展趨勢相關。更有趣的是，超二倍體多發生于髓系急性變患者；亞二倍體多發生于淋系急性變患者，這與本研究中的3例急變期患者CML進展趨勢非常一致。

多項研究證實，CML急變期伴有ACAs預后較差。急變期之前，出現17號染色體異常，提示預后不良；然而8號染色體異常所預示的預后價值目前還存在爭議。而眾所周知，21三體是唐氏綜合征(Down syndrome)的主要特征，本研究中4例CML患者存在21三體，且發生在CML不同階段，患者為成年或中老年，無智力異常及特殊面容，因此可以排除唐氏綜合征。-Y在正常的老年男性健康人群中也可以觀察到；因而本研究中-Y發生率有可能被高估；使用伊馬替尼治療的Y染色體缺失CML患者，細胞遺傳學、分子生物學反應及總生存明顯降低[7]。

本研究中17例患者BCR-ABL (P210) 融合基因檢測均為陽性，慢性期BCR-ABL (P210) 融合基因表達水平顯著低于加速期與急變期。研究認為BCR-ABL陽性的 CML 患者存在多種類型的基因不穩定性，如：染色體數量改變、假二倍體、DNA 缺失與嵌入等，從而導致了Ph1染色體以外的染色體改變。這些基因的變化是先于BCR-ABL融合基因發生還是由BCR-ABL融合基因引起？ 研究顯示基因不穩定性在異常造血干細胞克隆內先于Ph1染色體發生，而BCR-ABL融合基因進一步促進了遺傳不穩定性[8]。

本研究中CML患者多半來自外省市，在病例追蹤過程中流失較大，因而本研究缺乏伊馬替尼治療后ACAs發生率的比較以及分析；未能計算經歷完全細胞遺傳學緩解所需時間。本研究還將繼續，這樣會有更多的CML患者參與其中，在疾病的診斷、各階段以及伊馬替尼治療過程中，應用分子生物學與細胞遺傳學技術，檢測ACAs發生與變化，進一步揭示ACAs對CML致病以及預后的影響。

[1]Kurzrock R,Faderl S,Talpaz M,et al. The biology of chronic myeloid leukemia.[J]. New England Journal of Medicine,1999,341(3):164.

[2]Lee J,Kim D S,Lee H S,et al. Concurrence of e1a2 and e19a2 BCR-ABL1 Fusion Transcripts in a Typical Case of Chronic Myeloid Leukemia[J]. Annals of Laboratory Medicine,2017,37(1):74.

[3]Zaccaria A,Testoni N,Valenti A M,et al. Chromosome abnormalities additional to the Philadelphia chromosome at the diagnosis of chronic myelogenous leukemia:pathogenetic and prognostic implications[J]. Cancer Genetics & Cytogenetics,2010,199(2):76.

[4]Luatti S,Castagnetti F,Marzocchi G,et al. Additional chromosomal abnormalities in Philadelphia-positive clone:adverse prognostic influence on frontline imatinib therapy:a GIMEMA Working Party on CML analysis[J]. Blood,2012,120(4):761.

[5]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

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[7]Fabarius A,Leitner A,Hochhaus A,et al. Impact of additional cytogenetic aberrations at diagnosis on prognosis of CML:long-term observation of 1151 patients from the randomized CML Study IV[J]. Blood,2011,118(26):6760.

[8]Muvarak N,Nagaria P,Rassool F V. Genomic instability in chronic myeloid leukemia:targets for therapy?[J]. Current Hematologic Malignancy Reports,2012,7(2):94.

AnalysisofadditionalchromosomalabnormalitiesinPhiladelphia-positivecellswithchronicmyeloidleukemia

YUBo-hai1,2,RENShi3,ZHANGMeng2,etal.

(1.BiologyPost-doctorStation,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;3.InstituteofHematologyandOncology,TheFirstHospitalofHarbin,Harbin150010,China;4.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

ObjectiveTo investigate the clonal evolution of additional chromosomal abnormalities (ACAs) in Philadelphia-positive cells with chronic myeloid leukemia (CML).MethodsChromosome banding analysis was performed on bone marrow cells after 24 h short-term culture,and using conventional G-banding technique.Results219 patients were enrolled and ACAs occurred in 17 patients(7.8%),6.8% in chronic phase,7.7% in accelerated phase,and 11.8% in blast crisis (BC).ConclusionPerforming classic cytogenetics,both at diagnosis and during the course of the disease,is still the only way to detect the presence of and/or the development of ACAs,along with the possible pathogenetic,prognostic,and therapeutic implications.

Chronic myelogenous leukemia;Additional chromosome abnormalities;Karyotypic analysis

哈爾濱市科學技術局青年后備人才項目(No.2013RFQYJ081) 大連市衛生和計劃生育委員會科研項目(No.1611115)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2043-04

R733

A

于波海(1973-)，男，主任檢驗技師，博士，從事實驗診斷學、病原生物學研究。

2017-02-08)