SerpinA1在大腸癌中的表達及意義

喬 璐，張曉靜，王 海，高 申*，何成彥，黃麗紅

(吉林大學中日聯誼醫院 1.檢驗科；2.老年病科，吉林 長春130033)

SerpinA1在大腸癌中的表達及意義

喬 璐1，張曉靜1，王 海1，高 申1*，何成彥1，黃麗紅2

(吉林大學中日聯誼醫院 1.檢驗科；2.老年病科，吉林 長春130033)

目的探究SerpinA1蛋白在大腸癌及癌旁健康組織的表達差異，評估其作為大腸癌生物標志物的潛力和應用價值。方法將20例DukesB期大腸癌患者的腫瘤標本經二維液相色譜-質譜聯用法分析，得到大腸癌組織及癌旁健康組織表達差異顯著的25個蛋白，并用免疫印跡驗證SerpinA1蛋白的準確性。結果質譜鑒定后顯示，SerpinA1蛋白的表達水平在癌組織中明顯高于癌旁健康組織，并在免疫印跡實驗中得到證實。結論SerpinA1有可能成為新的大腸癌候選腫瘤標志物。

SerpinA1；大腸癌；二維液相色譜-質譜聯用法；免疫印跡

(ChinJLabDiagn,2017,21:2053)

大腸癌(CRC)是指產生于回盲部至肛門的惡性病變，包括結直腸癌和肛管癌，是目前癌癥死亡的第二大原因[1]。人口老齡化以及高脂低纖飲食是大腸癌發病的主要原因。大腸癌初期起病隱匿，多數無臨床癥狀，常有不同程度的延誤診斷。其死亡率與初步診斷大腸癌的分期呈正相關，若早期確診可通過手術切除使生存率顯著提高。轉移患者的5年生存率<10%，局部腺瘤息肉患者的生存率大于90%。目前公認的在結直腸癌診斷和術后監測有意義的腫瘤標志物是癌胚抗原(CEA)和CA19-9[2]。但認為CEA和CA19-9在早期大腸癌中缺乏診斷價值，且僅有45%病人升高。因此開發更敏感和特異性的標志物來檢測所有階段的大腸癌是至關重要的。SerpinA1(絲氨酸蛋白酶抑制劑A1)是具有高度保守結構的蛋白質，是人類最主要的蛋白酶抑制物，抑制能力占血漿總蛋白酶的90%以上[3]。它能不可逆的自殺性抑制多種絲氨酸內切肽酶(serineendopeptidase),如胰蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶等，保護細胞外基質免受絲氨酸蛋白酶的損傷，在維持細胞穩態方面發揮關鍵作用。同時也涉及一些非抑制作用如血液凝固，組織重塑，血管生成，炎癥反應，細胞凋亡和腫瘤轉移等。SerpinA1是一種急相時性反應蛋白，大部分由肝細胞合成，在單核巨噬細胞、腸上皮細胞、腎實質等肝外組織及某些腫瘤細胞中也可以產生[4]。國外研究顯示，很多惡性腫瘤如肝癌、肺癌、膀脫癌患者的腫瘤中SerpinA1表達水平均增高，但迄今為止對于其在大腸癌中的研究較少，因此本實驗采用二維液相色譜法-質譜聯用技術及免疫印跡技術，旨在探討SerpinA1在DukesB期大腸癌及癌旁健康組織中的表達情況及臨床意義，為大腸癌臨床診斷及發病機制提供新的檢驗指標。

1 材料與方法

1.1 組織來源

收集來自吉林大學中日聯誼醫院2015至2016年經病理學檢查證實為結直腸癌DukesB期腺癌的20例標本，排除了多發腫瘤患者及術中發現已發生轉移患者。手術前均簽署知情同意書且確定沒有接受任何治療。手術中取得的癌旁健康組織距腫瘤邊緣大于10 cm，且均取于腫瘤組織上端。待標本離體后，立即取材，生理鹽水沖洗，液氮凍存備用。

1.2 儀器及試劑

Bio-Rad公司的2-碘乙酰胺(IAM)、BCA蛋白質定量試劑盒、尿素(Urea)，Sigma公司的DNA酶和RNA酶,美國GE 公司的二硫蘇糖醇(DTT)、TMED、PMSF、TPCK 修飾的測序級胰酶，Beyotime公司的考馬斯亮藍G250，Milli-Q Integral超純水發生裝置，Agilent公司的1200納升級液相色譜分析儀和ThermoFisher公司的LTQXL線性離子阱質譜儀、UV-2000型分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1樣本總蛋白提取并測定濃度 分別取出液氮凍存的50 mg大腸癌組織及癌旁健康組織，放入液氮中研磨成粉末。加入裂解緩沖液(30 mmol/LTris-HCL,9 mol/LUrea,65 mmol/LDTT,2 mmol/LPMSF),室溫振蕩1 h，使混合物充分溶解，用RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA，離心后留取上清即為總蛋白質。采用Bradford法檢測蛋白濃度，考馬斯亮藍G250染色，用UV-2000型分光光度計在595 nm處比色，以蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線，從而計算出樣品的蛋白質濃度(mg/ml)。

1.3.2制備組織蛋白水解多肽混合物 用25 mmol/LNH4HCO3溶解稀釋提取的組織蛋白以降低尿素濃度，使其低于2 mol/L。加入一定體積1 mol/L的DTT，使其終濃度為20 mmol/L，56℃室溫避光放置1 h，使蛋白質中被氧化失活的-SH基團被還原。將反應物降至室溫，再加入1 mol/L的2-碘乙酰胺(IAM)，調定終濃度為50 mmol/L，室溫下避光反應30 mins。按1∶50(胰酶:蛋白質)的比例向反應體系中加入TPCK修飾的測序級胰蛋白酶,在37℃水浴箱中酶切孵育過夜,產物用真空抽干后分裝，-80℃保存。

1.3.3液質聯用技術分析分離鑒定多肽混合物 將上述樣本用0.1%FA溶解，取50 μg樣品色譜上樣，樣品依次通過串聯的強陽離子柱和C18反相柱進行洗脫分離。將洗脫的多肽用LTQXL質譜儀進行串聯質譜分析,質譜掃描方式為數據依賴方式。將質譜分析得到的MS/MS圖譜整合到Bioworks3.3.1SP1軟件包中的SEQUEST軟件，對強度為10個單位以上或有10個以上離子信號的譜圖進行數據庫檢索,對相關的蛋白及多肽進行鑒定。

1.3.4免疫印跡試驗 對選定的目標蛋白SerpinAl進行免疫印跡試驗，進一步驗證該蛋白在大腸癌組織是高表達的。SerpinAl單克隆抗體購自的美國Abgent公司,內參抗體為β-Actin。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 大腸癌組織及癌旁健康組織蛋白酶解混合產物的二維液相色譜-質譜聯用分析

采集、整理多肽質譜數據,其中腫瘤組織酶解混合物共鑒定了29795個多肽序列,得出854個蛋白質鑒定資料；癌旁健康組織共鑒定了4120個多肽序列,得出534個蛋白質鑒定資料。

2.2 大腸癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質的質譜分析

在這項研究中，兩組樣品中同一個蛋白質的豐度用譜圖數進行評價。對于滿足兩個樣品中的比值≥1同時兩個樣品中的差值≥72的蛋白質譜數，我們將其定義為蛋白豐度發生變化。本文主要探討顯著差異SerpinAl蛋白是明顯上調的，SerpinAl質譜結果見圖1。

2.3 免疫印跡驗證SerpinAl在大腸癌組織與癌旁組織的表達情況

用Westernblot檢測大腸癌及癌旁組織中SerpinAl蛋白的表達情況。結果證明SerpinAl蛋白在大腸癌中的表達水平明顯高于配對的癌旁健康組織,此結果進一步的驗證了二維液相色譜與質譜聯用鑒定的SerpinAl在大腸癌組織中的高表達，結果見圖2。

3 討論

大腸癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。在全世界，大腸癌的發病率位居第三，僅次于肺癌和乳腺癌。提高無癥狀人群的篩查，檢出早期癌及癌前病變并進行干預治療，是提高治愈率和生存率的關鍵。蛋白組包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質，蛋白質組學技術是指高通量、大規模研究蛋白質的特征，包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等。因此，利用蛋白組學技術探究腫瘤組織蛋白與癌旁組織蛋白表達水平上的差異，從而篩選出與腫瘤發生與發展密切相關的蛋白質，成為大腸癌防治研究中重要工具[5-7]。高表達的SerpinAl則可能成為腫瘤早期診斷新的潛在蛋白標記。

圖1 SerpinAl質譜圖

圖2 SerpinAl免疫印跡圖

研究表明，SerpinAl在多種癌癥中均呈高表達,如：肝癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等[8]。AroraPK等研究認為在腫瘤發展時細胞大量増殖、組織細胞壞死刺激了溶酶體蛋白酶類釋放,從而導致SerpinAl代償性増高[9]。也有人認為腫瘤細胞浸潤和轉移過程中,產生較多的IV型膠原酶可造成基膜崩解,從而有利于腫瘤的轉移擴散,為了防止彈性蛋白和膠原分解過度,抑制癌組織中多種溶組織酶活性,抵御癌細胞侵襲周圍組織,也可導致SerpinAl代償性増高[10]。Primhak等則認為癌細胞內SerpinAl的蓄積可能是腫瘤細胞原始蛋白的合成,是一種胎性基因產物的體現[11]。還有人將胰蛋白酶等視為一種淋巴細胞刺激原,其抑制劑SerpinAl便具有免疫抑制作用,當SerpinAl增高,機體就失去對突變細胞的免疫監視作用而誘生腫瘤[12]。SerpinA1高表達可使纖連蛋白上調，纖連蛋白又通過激活多種致癌途徑(如Akt，細胞外信號調節激酶，信號轉導和轉錄激活因子3)促進腫瘤的進展[13]。國外學者研究顯示，SerpinAl表達隨分期的升高以及淋巴結的轉移而升高，各分期患者之間SerpinAl表達有明顯差異，表明SerpinAl參與了腫瘤生長、侵襲和轉移等多個過程，是大腸癌的新型預后生物標志物和候選治療靶標[14]。

本實驗采用液質聯用及蛋白質印跡技術分別驗證了SerpinAl在大腸癌組織中表達蛋白量明顯高于癌旁健康組織。因此，檢測大腸癌組織中SerpinAl水平可以作為一種輔助標志物來早期篩查癌變，為大腸癌的初篩和研究提供了新途徑。但是SerpinA1在腫瘤進展中的機制尚未完全闡明，須進一步深入和完善。

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ExpressionandSignificanceofSerpinA1incolorectalcancer

QIAOLu,ZHANGXiao-jing,WANGHai,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo research the expression status of SerpinA1 in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues.MethodsTwo-dimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry analyzes samples of 20 patients with colorectal carcinoma,finding differentially expressed protein and selected SerpinA1.Then the result of SerpinA1 was identified by Westernblot.ResultsVerification by mass spectrometer reveals that SerpinA1 express importantly higher in colorectal cancer tissues than adjacent normal tissues,with result verified the accurateness by westernblot.ConclusionThe increase of SerpinA1 expression may well have a closely relationship with colorectal cancer.

SerpinA1;colorectal cancer;LC-MS;Westernblot

國家自然科學基金資助(81572082)；吉林省科技廳資助(20140311092YY，20150101153，20150414015)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2053-04

R735.3

A

2017-02-21)