激活素-卵泡抑素系統在病理性瘢痕中的表達

侯 亮,張 揚,孫軼峰,高 旭,李 紅*

(1．吉林銘醫整形美容醫院，吉林 長春130021；2．吉林大學藥學院，吉林 長春130022)

激活素-卵泡抑素系統在病理性瘢痕中的表達

侯 亮1,張 揚2,孫軼峰1,高 旭1,李 紅1*

(1．吉林銘醫整形美容醫院，吉林 長春130021；2．吉林大學藥學院，吉林 長春130022)

目的探討激活素-卵泡抑素系統(activin-FS)在病理性瘢痕組織中的表達。方法收集2014-06/2017-06吉林銘醫整型美容醫院整形外科組織標本，分為病理性瘢痕組46例(包括瘢痕疙瘩組25例和增生性瘢痕組21例)、非病理性瘢痕組30例和正常皮膚組27例。采用免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)方法分別檢測activin A及FS的蛋白表達情況；RNA酶保護試驗(RNase protection assay，RPA)分析activin A的mRNA表達水平。結果免疫組化結果顯示，activin A和FS在正常皮膚和病理性瘢痕的表皮基底層均有表達，且病理性瘢痕組較正常皮膚組染色程度加深(P<0.05)。RNA酶保護試驗結果顯示，正常皮膚組和非病理性疤痕組activin-A mRNA表達水平極低，而病理性瘢痕組表達則明顯增多。結論activin-FS系統可能參與病理性瘢痕的發生發展。

病理性瘢痕；激活素；卵泡抑素；免疫組織化學；RNA酶保護試驗

(ChinJLabDiagn,2017,21:2093)

瘢痕是在創傷愈合過程中必然生成的產物，在臨床上包括病理性瘢痕和非病理性瘢痕。機體多數組織損傷均可通過瘢痕的產生來修復，而瘢痕疙瘩(keloid)和增生性瘢痕(hypertrophic scar)則是由于成纖維細胞過度增殖和膠原過度合成所致的結締組織增生性疾病，為臨床多見的病理性瘢痕。瘢痕發生時，增厚的瘢痕組織不僅嚴重影響美觀，而且后期較易發生攣縮導致組織或器官移位變形，甚至關節功能障礙。因此病理性瘢痕的預防和治療一直是整形外科亟待解決的問題之一，但其病因及形成機制尚不明確。目前認為病理性瘢痕與基因表達、細胞信號傳導通路、膠原代謝以及細胞增殖等密切相關[1-3]。有研究表明，激活素A(activin A)及卵泡抑素(follistatin，FS)參與創傷修復過程，刺激成纖維細胞的增殖和合成膠原[4,5]。本研究通過免疫組化方法和RNA酶保護試驗，檢測activin A-FS系統在病理性瘢痕中的表達情況，旨在為探討病理性瘢痕的發生發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1標本獲取選取2014-06/2017-06吉林銘醫整形美容醫院整形外科手術患者，取自面部、前胸、肩背部、耳垂部及四肢等部位的組織標本。所有瘢痕組織標本均來自瘢痕修復手術切除的瘢痕組織；正常皮膚組織來自植皮術中供皮區剩余的皮膚組織；常規石蠟切片，HE染色經兩位病理醫師鑒別診斷；所有患者均獲得知情同意。患者均無皮膚、免疫、傳染等全身性疾病，瘢痕表面無感染和潰瘍，術前均未行激素及免疫抑制劑治療。病理性瘢痕組分為瘢痕疙瘩25例，年齡18-55歲；增生性瘢痕21例，年齡10-56歲。非病理性瘢痕組30例，年齡9-52歲。正常皮膚組27例，年齡17-54歲。

1.2主要試劑Activin-βA及FS山羊多克隆抗體(R&D Systems)；HRP標記的免抗羊和DAB試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；Trizol(美國Gibco公司)；RPA試劑盒和同位素α-32P-UTP(美國NEN公司)

1.3免疫組化染色常規制備石蠟切片，連續切成5 μl薄片，黏附于多聚賴氨酸處理的玻片上，在60℃烘箱中烤1.5 h，依次用二甲苯及梯度濃度乙醇水化，蒸餾水洗滌3次。將玻片置于含0.01 M檸檬酸鈉(pH 6.0)的緩沖液中，加熱處理8 min，PBST洗滌3次；滴加3%H2O2處理30 min,去除內源性的過氧化氫酶。PBST洗滌3次，每次5 min。分別滴加activin-βA(1∶200)或FS(1∶400)，4℃孵育過夜，次日PBST洗滌3次，每次5 min；滴加羊抗鼠的二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗滌3次，每次5 min。滴加50 μl的DAB顯色液，邊染色邊在顯微鏡下觀察。染色結束后自來水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯脫水干燥，并用中性樹脂封片。每批標本均設已知陽性對照和PBS替代一抗的空白對照。每張切片隨機選取5個完整且不重疊的高倍鏡視野(×400)，測定每個視野下陽性反應的累積光密度和所有細胞總面積，采用專業軟件分析activin-A和FS蛋白的表達。

1.4RNA酶保護試驗利用Trizol提取各組織總RNA。根據文獻[6]方法進行RPA，重復獨立試驗2次。應用文獻[7]中activin-βA的cDNA模板。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照。帶有基因表達條帶的膠片經掃描后，自動讀取基因表達強度的數值。

1.5結果分析與統計學處理應用 SPSS 12.0 軟件進行統計學分析，結果均以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1免疫組化檢測結果

如圖1所示，activin A在正常皮膚(圖1a)和病理性瘢痕(圖1d)的表皮基底層均有表達；與正常皮膚組相比，病理性瘢痕組染色程度明顯加深。FS亦呈現類似的表達情況(圖1b和圖1e)。病理性瘢痕組activin A和FS蛋白的平均光密度值分別與正常皮膚組相比，兩者之間差異均具有統計學意義(P<0.05，表1)。

箭頭D和E分別代表真皮層和表皮層

2.2RNA酶保護分析

內源性activin-βAmRNA表達情況如圖2所示。activin-A mRNA在正常皮膚組和非病理性瘢痕組的表達均為極低水平，而病理性瘢痕組則顯著增強。

表1 不同組織中激活素A和卵泡抑素蛋白的平均光密度

*與正常皮膚組比較，P<0.05。NS：正常皮膚，Non-PS：非病理性瘢痕，PS：病理性瘢痕。

3 討論

病理性瘢痕是由于全身以及局部因素的影響，引發異常的損傷修復過程，是創傷部位過度修復的結果。其形成涉及多種細胞、細胞因子、生長因子及細胞間的相互作用。近年來研究顯示，轉化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族在病理性瘢痕的發病過程中起著重要的橋梁作用，其主要參與抑制免疫反應，調節細胞增殖分化和促進細胞外基`[8,9]。

Lane 1,2：正常皮膚，Lane 3-6：病理性瘢痕，Lane 7,8：非病理性瘢痕

圖2RNA酶保護試驗測定不同組織中activin-βAmRNA表達情況

激活素A(activin A)是TGF-β超家族球蛋白成員之一，是一種由性腺分泌的大分子糖蛋白，其最早在雌豬卵泡液中被分離出來。activin A有3種不同類型的受體，它可在Ⅲ型受體的輔助下，與Ⅱ型受體結合，并與磷酸化的ActR I形成三元絡合物，再使胞漿內的Smad 2和Smad 3磷酸化，最后將信號傳遞至細胞核，并在細胞核中調節目的基因的表達[10]。正常的activin A在維持細胞增殖、黏附、凋亡及分化過程中發揮著重要作用。近年來有研究發現，在諸多組織器官炎癥[11]和纖維化[12,13]過程中activin A表達亦增高。卵泡抑素(follistatin，FS)是activin A 的特異性結合蛋白，拮抗activin A的生物活性，進一步抑制細胞內的Smad2/3的信號激活[10]。Munz等[14]發現，高表達activin A的轉基因鼠真皮層明顯增厚，且傷口愈合加快。而Wankell等在FS轉基因鼠中觀察結果正好相反[15]。

本研究通過免疫組化方法檢測activin A在病理性瘢痕中的表達，發現其在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕中的表達均高于正常皮膚和非病理性瘢痕。RNA酶保護性測定亦顯示，病理性瘢痕activin-A mRNA表達水平較正常皮膚和非病理性瘢痕顯著增強。FS亦顯示相似的表達情況。值得注意的是，本實驗觀察到activin A和FS蛋白均在表皮基底層定位表達，由此可以設想，activin-FS系統能夠調控表皮基底角質形成細胞的動力學過程，加速其遷移及上皮間質轉化，從而參與創面修復及瘢痕形成[16]。

綜上所述，activin A和FS在病理性瘢痕病變的發展中起到重要的作用。因此，通過特異干預兩者的表達，必定對核內的轉錄產生影響，可能會成為病理性瘢痕潛在的治療策略。

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Expressionsofactivin-FSsysteminpathologicalscars

HOULiang1,ZHANGYang2,SUNYi-feng1,etal.

(1.JilinMoiiMedicalCosmetologyHospital,Changchun130021,China; 2.SchoolofPharmaceuticalScienceofJilinUniversity,Changchun130022,China)

ObjectiveThe aim of this study is to detect the expressions of activin-A and follistatin (FS) and investigate their relationship in pathogenesis and development of pathological scars.MethodsExperimental samples were obtained from the patients,who underwent burn and plastic surgery at Department of Plastic Surgery,Jilin Moii Medical Cosmetology Hospital,from June 2014 to June 2017,including 25 patients with keloid,and 21 patients with hypertrophic scars.Normal skin and non-pathological scars from additional 27 and 30 cases respectively were served as controls.The expression of activin-A and FS protein in pathological scars,non-pathological scars and normal skin were examined by immunohistochemistry (IHC)(P<0.05).The expression of mRNA in these tissues were performed by RNAase protection assay (RPA).ResultsIHC showed increased localization of both activin-A and FS in the basal layer of epidermis of pathological scars compared with normal tissue.Increased mRNA expression for activin A was observed in pathological scars by performing RPA.ConclusionThese findings emphasize the importance of the activin-FS system in biology and pathogenesis of pathological scars.

pathological scars；activin;follistatin;immunohistochemistry;RNAase protection assay

吉林省衛生計生青年科技骨干培養計劃項目(編號：2017Q032)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2093-04

R619+.6

A

2017-08-14)