標本溶血對常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結(jié)果的影響

聶 群,董 晶,聶李平,周 宇,謝聞悅,李建新*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳518120；2.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518036)

標本溶血對常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結(jié)果的影響

聶 群1,董 晶2,聶李平2,周 宇2,謝聞悅2,李建新2*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳518120；2.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518036)

目的探討標本溶血對常規(guī)凝血試驗(包括PT、APTT和Fbg)和纖溶標志物(包括D-dimer和FDP)測定結(jié)果的影響。方法對48例溶血標本和2 h內(nèi)(平均65 min)重新采集的未溶血配對標本分別進行常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定；另對30例未溶血標本體外機械誘導溶血，分別于溶血前后進行常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定。結(jié)果對于臨床溶血和未溶血配對標本，PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP在兩者間均無顯著性差異；對于誘導溶血標本，誘導溶血前后PT、APTT、Fbg和FDP均無顯著性差異；誘導溶血后較溶血前D-dimer降低(361.10±493.40 VS 396.37±494.47 μg/L，P< 0.001)。以上參數(shù)結(jié)果在溶血和未溶血標本之間，Pearson相關(guān)分析均呈高度相關(guān)(r均>0.97，P均<0.001)，Bland-Altman圖均顯示一致性良好。以上參數(shù)改變值和溶血程度均不相關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論標本溶血對常規(guī)凝血試驗和FDP的測定結(jié)果無明顯影響，體外機械誘導溶血對D-dimer測定結(jié)果造成較小的負性影響，但不影響臨床決定。應對拒收溶血標本用于常規(guī)凝血測試的規(guī)定進行再評估。

溶血；常規(guī)凝血試驗；D-dimer；FDP

(ChinJLabDiagn,2017,21:2115)

常規(guī)凝血試驗[包括凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)]是臨床血凝實驗室執(zhí)行得最多的測試，廣泛用于篩選檢測遺傳性和獲得性凝血缺陷、抗凝和溶栓治療監(jiān)測、術(shù)前患者止凝血功能評估、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的篩選診斷、凝血抑制物篩選、靜脈血栓篩查等[1，2]。纖溶標志物D-二聚體(D-dimer)和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin/fibrinogen degradation products,FDP)也是臨床頻繁地申請的止血檢測項目，在輔助排除診斷靜脈血栓形成(venous thromboembolism,VTE)、判斷VTE再發(fā)風險、評估抗凝治療持續(xù)時間、DIC的診斷和管理方面具有非常重要的意義[3，4]。FDP和D-dimer聯(lián)合檢測還可以鑒別診斷原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶[5]。

凝血試驗易被一些分析前技術(shù)變量影響，如采血裝置、標本收集管、標本運送和儲存條件等等[6，7]。在送達臨床實驗室的凝血試驗標本中，溶血是較常見現(xiàn)象[7]。溶血可能導致凝血因子活化和干擾測量終點判讀，因此，美國臨床實驗室標準化研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)H21-A4指南規(guī)定，對于常規(guī)凝血試驗如PT和APTT，應拒收肉眼可見的溶血標本[6]。Laga AC等[7]報道，標本溶血雖然影響PT和APTT測試結(jié)果，但影響程度較輕，似乎對臨床決定無重要意義。但Lippi等[8]根據(jù)他們以凍融法誘導溶血的實驗結(jié)果認為，僅輕微溶血標本可供凝血測試，中度以上的溶血標本會影響常規(guī)凝血試驗結(jié)果的可信度。基于這些，在CLSI新的H21-A5指南[9]中，無明確規(guī)定應拒收溶血標本用于常規(guī)凝血試驗。

關(guān)于標本溶血對纖溶分子標志物D-dimer和FDP測定的影響，相關(guān)報道較少。本文從兩個方面前瞻性研究標本溶血對常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結(jié)果的影響：首先研究臨床送檢的溶血的凝血測試標本和2小時內(nèi)重新采集的非溶血配對標本的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結(jié)果差異，再研究標本在機械誘導溶血前后的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結(jié)果差異。

1 材料與方法

1.1 臨床溶血標本

患者靜脈血采集于2 ml 109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管(廣州陽普公司)，血液與抗凝劑的比例為9∶1。溶血定義為標本經(jīng)2 500×g離心15 min后，血漿以裸眼觀察呈粉紅色到紅色。接收到溶血標本后，立即通知臨床重新采集非溶血標本送檢。時間間隔在2 h內(nèi)的溶血和非溶血配對標本才納入本研究。常規(guī)凝血試驗在標本接收后2 h內(nèi)以Sysmex CA 1500和Stago Compact血凝儀完成測試，每對溶血和非溶血配對標本只在一臺血凝儀上測試。Sysmex CA 1500血凝儀常規(guī)凝血試驗所用試劑由德國Siemens公司提供，PT試劑為Thromborel-S，APTT試劑為Actin和0.025 mol/L氯化鈣，F(xiàn)bg試劑為Thrombin Reagent (100NIH)。Stago Compact血凝儀采用其配套試劑，PT試劑為STA○RNeoplastine○RCI Plus 10，APTT試劑為STA○RPTT Automate 5，F(xiàn)bg試劑為STA Fibrinogen 5。D-dimer和FDP測定也在標本接收后2 h內(nèi)完成，所用儀器為Sysmex CA 1500。D-dimer測定采用Siemens公司的D-dimer Assay PLUS試劑，該試劑采用D-dimer單克隆抗體，特異性強，不受纖維蛋白原和其他纖維蛋白降解產(chǎn)物的影響；采用乳膠增強型免疫比濁法進行檢測，最低檢測限值為50 μg/L，檢測線性范圍為50-9999 μg/L，CV < 5%。FDP測定也采用乳膠增強型免疫比濁法試劑，生產(chǎn)廠家為日本第一化學株式會社。

1.2 體外機械誘導溶血標本

隨機收集未溶血凝血測試標本30例，先作常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP測試，再蓋上蓋子，在混旋器上強力混旋30 min，人為機械劇烈震蕩誘導標本溶血，2 500 × g離心15min后再作常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP測試。所有測試在3 h內(nèi)完成。

1.3 血漿游離血紅蛋白(free hemoglobin,fHgb)測定

采用鄰-甲聯(lián)苯胺法，按操作規(guī)程[10]測定。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 臨床溶血標本

一共48對溶血和非溶血配對標本納入研究。34對標本來自ICU，4對來自CCU，其它來自產(chǎn)科、神經(jīng)內(nèi)科、內(nèi)分泌科、神經(jīng)外科、消化內(nèi)科等。溶血和非溶血配對標本的采集時間間隔平均為65 min。32對標本的常規(guī)凝血試驗在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對標本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。溶血標本的血漿fHgb為2.01±1.37 g/L，覆蓋了臨床常見標本溶血的血漿fHgb范圍。

溶血和未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果均無顯著性差異(P均>0.05，表1)，且均呈高度相關(guān)(r均>0.97，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，溶血和未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內(nèi)，也即溶血和未溶血配對標本的結(jié)果一致性良好。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP改變值與fHgb不相關(guān)，r分別為-0.176、-0.032、0.131、0.030和-0.160，P分別為0.232、0.829、0.375、0.840和0.277。

表1 溶血和重采未溶血配對標本的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物結(jié)果

2.2 體外機械誘導溶血標本

14對標本的常規(guī)凝血試驗在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對標本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。誘導溶血標本的血漿fHgb為1.71±1.29 g/L。

誘導溶血前后的PT、APTT、Fbg和FDP結(jié)果均無顯著性差異(P均>0.05)，但誘導溶血后較溶血前D-dimer降低(P< 0.001)(表2)，溶血前后的結(jié)果均呈高度相關(guān)(r均>0.98，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，誘導溶血前后的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內(nèi)，也即誘導溶血前后的結(jié)果一致。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP的結(jié)果差值與fHgb不相關(guān)，r分別為0.068、-0.084、0.108、0.010和-0.160，P 分別為0.722、0.657、0.5705、0.398和0.958。

表2 體外機械誘導溶血前后的的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物結(jié)果

3 討論

標本溶血往往是因為采集、運輸過程中方法不當引起的。針頭過細、抽入氣泡、止血帶扎的時間過長以及運輸過程中的不當?shù)仍蚨伎稍斐蓸吮救苎吮救苎禽^常見現(xiàn)象，約占送達臨床實驗室標本的3%左右[7,11]，約占標本不合格原因的40%-70%[11]。標本體外溶血通過一系列機制影響臨床化學測試結(jié)果[11]。標本溶血導致帶負電荷的紅細胞膜磷脂暴露，可能會加速凝血激活，或者與凝血活酶試劑競爭結(jié)合因子VII而減慢凝血過程；另一方面，標本溶血會干擾凝血儀對反應終點的測量，從而影響凝血試驗測試結(jié)果[6,7]。

Laga AC等[7]的結(jié)果表明，溶血標本所釋放的基本上為游離形式，而非結(jié)合于微囊形式的血紅蛋白，對凝血系統(tǒng)的活化作用有限；標本溶血可導致外源凝血途徑活化輕度增高(FVIIa和F1+2水平輕度增高)，使臨床溶血標本和機械誘導溶血標本的PT和APTT測試結(jié)果縮短，但影響程度較輕，對臨床決定似乎無重要意義。Tang N等[12]報道，雖然機械誘導的溶血會干擾血栓彈力圖的測定，但對常規(guī)凝血試驗(PT、APTT和Fbg)的結(jié)果影響甚微，偏差低于美國臨床實驗室修正法案的允許范圍。D'Angelo G等[13]也報道，即使嚴重溶血，對PT和APTT的測定影響很小，但導致Fbg的降低和D-dimer增高，這可能與他們制備溶血液時間過長以及采用凍融程序?qū)е履せ钣嘘P(guān)。

Lippi G等[14]和La'ulu SL等[15]報道，機械誘導的溶血對D-dimer測定造成較小的負性影響。Lippi G等[14]認為，大多數(shù)輕度溶血樣本的D-dimer測定結(jié)果可以發(fā)向臨床。

我們的實驗結(jié)果表明，臨床溶血和重采未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果均無顯著性差異，且均呈高度相關(guān)，Bland-Altman圖顯示以上指標的結(jié)果差值均較小，也即兩者間的結(jié)果一致性良好；體外機械誘導溶血與臨床溶血標本的結(jié)果類似，雖然對D-dimer測定造成較輕的負性影響(約降低10%)，但誘導溶血前后D-dimer結(jié)果高度相關(guān)，Bland-Altman圖顯示結(jié)果一致。這可能與機械誘導溶血對凝血系統(tǒng)的活化作用較弱[7]，以及溶血干擾比色法吸光度測定有關(guān)。同時也說明體外運輸?shù)葯C械因素導致的標本溶血對常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP的測定結(jié)果影響有限，不影響臨床決定。

由于標本溶血是臨床實驗室的較常見現(xiàn)象，對溶血標本重新采集需耗費大量的人力、物力以及時間成本。基于標本溶血對常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP的測定結(jié)果影響有限，應對拒收溶血標本用于常規(guī)凝血測試的規(guī)定進行再評估。

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Theeffectofspecimenhemolysisonroutinecoagulationtestandfibrinolyticmarkerresults

NIEQun,DONGJing,NIELi-ping,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapengNewDistrictMaternalandChildrenHealthHospital,Shenzhen518120,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of specimen hemolysis on routine coagulation test (including PT,APTT and Fbg) and fibrinolytic marker (including D-dimer and FDP) results.MethodsRoutine coagulation test and fibrinolytic marker were executed for 48 consecutive hemolyzed patient samples and paired re-collected (within 2 hours) nonhemolyzed specimens,and for randomly collected 30 nonhemolyzed specimens before and after mechanically induced hemolysis.ResultsIn 48 paired patients,there were no statistically significant differences in PT,APTT,Fbg,D-dimer and FDP results between hemolyzed and nonhemolyzed specimens,respectively.In 30 randomly collected specimens,significant differences were not seen in PT,APTT,Fbg and FDP values before and after induced hemolysis.Dimer decreased (361.10±493.40 vs 396.37±494.47 μg/L,P<0.001) after induced hemolysis.Pearson correlation analysis showed high correlation (allr>0.97,P<0.001),and Bland-Altman plot exhibited good agreement,in results of above-mentioned tests between hemolyzed and nonhemolyzed specimens.Differences in the results of above tests were not correlated with the degree of hemolysis (allP>0.05).ConclusionThere was no significant effect of specimens hemolysis on the results of routine coagulation test and FDP.Minor negative effect on D-dimer determination was seen in mechanically induced hemolyzed specimens in vitro,which is unlikely to be considered clinically meaningful.A policy of rejecting hemolyzed specimens for coagulation tests should be reevaluated.

hemolysis;routine coagulation test;D-dimer;FDP

深圳市科技創(chuàng)新委基礎研究資助項目(JCYJ20150403091443282)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2115-04

R331.1

A

2017-06-15)