刺五加皂苷對淀粉樣前體蛋白APP酶解通路的影響

劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬

(延邊大學醫學院 預防醫學教研室，吉林 延吉133002)

刺五加皂苷對淀粉樣前體蛋白APP酶解通路的影響

劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬*

(延邊大學醫學院 預防醫學教研室，吉林 延吉133002)

目的研究刺五加皂苷對APP(Amyloid Precursor Protein，APP)酶解通路的影響。方法(2015.9-2016.5)用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理胚鼠皮層神經元細胞，采用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測γ-分泌酶活性；另用脂質體2000轉染構建APP695高表達CHO細胞系,用G418(500 mg/L)進行篩選獲得APP695-CHO穩轉染細胞，用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理穩轉染細胞，48 h后，ELISA法檢測細胞培養上清中Aβ1-40含量，用Western-blot法檢測細胞裂解液中APP-N端片段蛋白的表達。結果在胚鼠皮層神經元細胞與對照組相比，25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷能夠抑制內源性γ-內切酶的活性，而且隨著濃度的升高，抑制作用增強；在APP695-CHO穩轉染細胞中，Aβ1-40的分泌量增高，APP-N端片段的蛋白表達水平減少，不同劑量刺五加皂苷能緩解這些變化。結論刺五加皂苷能抑制內源性γ-內切酶減少Aβ1-40的生成，對APP酶解起到一定的影響，對阿爾茨海默病的發病及進展有一定的保護作用。

刺五加皂苷；β淀粉樣蛋白；γ-內切酶；阿爾茨海默病；APP-N端片段

(ChinJLabDiagn,2017,21:2173)

1 材料與方法

1.1材料

CHO細胞株來自于上海良一醫藥科技有限公司。APP695是由韓國首爾醫科大學藥理學教室徐裕憲教授饋贈。刺五加皂苷購于上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、LB培養基、DAPT(γ-內切酶抑制劑)、G418、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、DH-5α購于碧云天生物科技有限公司；DMEM培養液、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(Corning，N.Y,14831，USA)；NDiff Neuro-2(N2)培養基補充劑購于德國默克密理博公司； QIAGEN Plasmid Maxi Kit 購于QIAGEN; Lipofectin2000從invitrogen公司購買；人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯免疫分析、大鼠γ-分泌酶(γ-Secretase)酶聯免疫分析試劑盒購于上海酶聯(mlbio)生物公司。

1.2實驗儀器

CO2培養箱、低速容量離心機、電泳儀、立式壓力蒸汽滅菌器、冷凍離心機、恒溫培養箱、酶標儀、恒溫振蕩器、紫外分光光度計等均由延邊大學醫學院預防醫學教研室提供。

1.3實驗方法

1.3.1質粒的擴增和抽提

把含有重組質粒V-Flag-APP695和空載體V-Flag的菌種放入含氨芐青霉素(Amp)的固體培養基中，先經過小培養，然后轉入到大培養。根據質粒抽提試劑盒來提取質粒，并測定質粒的濃度和純度。

要形成以學生為主體的教學課堂，使學生作為課堂知識的主要吸收者和接受者。通過課堂教學發表自身的意見和看法，并從每節課的學習中不斷積累自身的知識儲備。語文作為一門從小就接觸的學科，對學生的成長成才起著關鍵的作用。因此，學生在學習語文的過程中要擺正自身的姿態，積極主動地去學習和探索語文的知識。例如，關于作文的寫作方面，在寫到關于人文素養題材的作文時，教師可以引用一些有關此題材的故事，或優秀作文，讓學生自主進行討論，從中汲取此類題材的關鍵點進行構思和框架的構建，這也是提升個人人文素養的一個途徑。

1.3.2CHO細胞培養

把CHO細胞培養于37℃、5% CO2條件下的二氧化碳培養箱中。

1.3.3細胞轉染

依照轉染試劑盒說明書，把APP695基因轉染到CHO細胞中，用G418(500 mg/L)篩選陽性克隆，再用Western-blot檢測APP-N端片段蛋白的表達。

1.3.4胚鼠皮層神經元細胞培養

取懷孕16-18 d的SD大鼠，乙醚麻醉取出胚胎，放入D-hank’s液中，將胎鼠斷頭取大腦皮層組織，將其剪碎消化分解后，終止消化，離心去上清，再用DMEM培養液吸打靜止后，接種到六孔板中，于CO2培養箱中過夜，次日換成有1%N2的DMEM培養液，第四天再換成含有10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM培養液，7 d后給予續處理。

1.3.5放射免疫法測定Aβ1-40含量

空質粒轉染對照組、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷和γ-內切酶抑制劑5 μmol/L DAPT分別處理轉染后的細胞，48 h后收集細胞培養液，依照人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯免疫試劑盒的要求測定Aβ1-40的含量。

1.3.6ELISA法測定γ-內切酶活性

分別向胚鼠神經元細胞中加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷，48 h后收集培養液，按照γ-分泌酶ELISA試劑盒的說明書操作，酶標儀測定吸光度，計算得出γ-內切酶的濃度。

1.3.7APP-N端片段蛋白水平檢測

采用蛋白印跡法測定蛋白水平。細胞獲取蛋白后進行電泳實驗，以β-tubulin作為內參照，計算蛋白表達水平。

1.3.8統計分析

采用SPSS17.0統計軟件進行統計處理，計量資料以表示，多個樣本均數比較，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1Aβ1-40含量比較轉染APP695-V-Flag模型組與轉染空載體V-Flag對照組比較，Aβ1-40的含量明顯增加(P<0.05，表1)；DAPT處理組、刺五加皂苷低、中、高劑量組與模型組相比，Aβ1-40含量明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 刺五加皂苷對CHO/APP695細胞中Aβ1-40含量的影響

與對照組比較，△代表P<0.05；與模型組比較，*代表P<0.05

2.2刺五加皂苷對γ-內切酶活性的影響胚鼠皮層原代培養細胞DAPT處理組跟空白對照組比較，γ-內切酶活性明顯下降；刺五加低、中、高劑量組γ-內切酶活性與空白對照組比較明顯降低(P<0.05,表2)。

表2 刺五加皂苷對胚鼠神經元細胞內源性γ-內切酶活性的影響

與正常對照組比較，*代表P<0.05

2.3APP-N端片段蛋白表達水平測定轉染重組質粒V-Flag-APP695組比轉染空載體V-Flag組蛋白表達水平明顯增加，DAPT+APP695處理組比APP695處理組蛋白表達水平有所增加，刺五加皂苷(低、中、高)+APP695處理組與APP695模型組相比較，APP-N端蛋白表達水平升高,具有顯著性差異(P<0.05，圖1)。

*代表與模型組比較P<0.05,#代表與對照組比較P<0.05

3 討論

阿爾茨海默病(AD)是β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)積累的結果，是淀粉樣前體蛋白(APP)經β和γ-分泌酶水解而產生[6]，而γ-分泌酶切割APP產生的疏水性Aβ40是形成Aβ的主要原因，所以γ-內切酶是APP水解產生Aβ的關鍵酶，是防治阿爾茨海默病很有潛力的靶點。γ-分泌酶是產生Aβ的限速酶，直接關系到AD的發病與否，能切割各種Ⅰ型跨膜蛋白,包括 APP 和 CD44等[7,8]。

γ-分泌酶抑制劑(GSIS)已用于臨床研究,但如DAPT或其他γ-分泌酶抑制劑和β-分泌酶抑制劑，由于藥物用藥的安全性以及其長時間應用時出現的副作用，不適于長期使用。所以我們必須找到長期比較安全使用的一些組分，這些保護成分可以來自從中草藥或微量元素或食品。因此，本次研究我們觀察了刺五加皂苷對APP的酶解途徑的影響。結果顯示，刺五加皂苷可以抑制γ-內切酶的活性，進而減少Aβ1-40的產生，其APP-N端蛋白表達水平升高。在HT22細胞和穩定表達Sweidish 突變型APP的SH-SY5Y細胞中，Shi Chung等人報道人參皂甙Rg1促進APP非淀粉樣酶切通路，增加α-分泌酶的活性以及細胞外的Aβ1-40和分泌型sAPP(α)的含量，闡明了人參皂甙Rg1對老年性癡呆酶解通路的干預作用[9]。Koivisto等人報道魚油含EPA和DHA，可以緩解老年性癡呆模型APPswe/PS1dE9 轉基因小鼠的認知障礙和腦部淀粉樣蛋白的沉積，其機制為降低β-分泌酶和γ-分泌酶的活性減少Aβ1-42的含量[10]。我們的研究結果與這些結果保持一致性，刺五加皂苷抑制γ-內切酶的活性，進而減少Aβ1-40的產生，干預老年性癡呆酶解通路，可以起到預防和治療老年性癡呆有保護作用。

刺五加皂苷具有調控心腦血管系統，抑制癌細胞增殖，降低糖尿病，抗炎，增強免疫力，抗疲勞等藥理作用[11]。刺五加含有超氧化物歧化酶復合物，具有很好的抗氧化功能，可增強免疫力和抗自由基的作用[12]。刺五加皂苷E 和異秦皮啶對Aβ25-35誘導的軸突和樹突的萎縮具有明顯的保護作用[13]。刺五加皂苷能顯著抑制α-synuclein誘導的毒性[14]。刺五加提取物可提高紋狀體多巴胺(DA)含量，平衡紋狀體的行為激活和抑制作用，保護DA神經元凋亡，減輕帕金森病小鼠的死亡率[15]。之前，我們研究組通過體內和體外實驗表明了刺五加對老年性癡呆的保護作用，刺五加皂苷對Aβ25-35誘導PC12細胞的細胞毒性和細胞凋亡的有較好的保護作用[16]。刺五加提取液對半衰老模型小鼠學習記憶能力減退及腦組織MDA 、SOD、膽堿酯酶(TchE)、單胺氧化酶(MAO)活性變化有較好的保護作用[17,18]，提示刺五加可能的保護機制是其抗氧化作用。這些報道均提示刺五加對神經變性疾病如老年性癡呆或帕金森病有保護作用。

APP是跨膜蛋白，APP經過β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下產生Aβ1-40或Aβ1-42，可以被a-分泌酶的作用下產生分泌型APP(SAPP)，最近報道也可以被ε-,δ-,η分泌酶的作用下產生不同的C-端片段[19]。此次研究我們就測定了γ-內切酶的活性和Aβ1-40的含量以及APP-N端蛋白表達水平，今后我們想繼續對APP酶解相關的其他酶和相關基因進行更深層次研究，對β-分泌酶、α-分泌酶的活性以及各分泌酶的相關基因如PS1(γ-)、PS2(γ-)、BACE1(β-)、AMDM10(α-)的蛋白質和mRNA水平的表達。綜上所述，刺五加皂苷對老年性癡呆有較好的保護作用，其保護作用的分子生物學機制可能是對APP酶解通路的干預作用，其更深的分子生物學機制有待于進一步研究和探討。

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EffectofAcanthopannxSenticoususSaponinsonprocessingPathwayofAmyloidprecursorprotein

LIUFang，LIJing-yang，QIUYe,etal.

(DepartmentofPreventiveMedicine,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China)

ObjectiveTo study the effects of Acanthopannx Senticousus Saponins(ASS) on processing pathway of amyloid precursor protein(APP).Methods(2015.9-2016.5)12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to primary culturedrat cortical neuron cells， the activity of γ-secretase was measured by ELISA analysis;The APP695 gene was transfected into CHO cells using Lipper 2000 reagent.Stably transfected cells were sclected by G418(500 mg/L).12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to stably transfected cellsfor 48 hours,ELISA assay was used to detected Aβ1-40concentration in the supernatant of cell culture medium.Western-blot analysis were used to detected the APP-N terminal fragment protein expression from cell lysate.ResultsIn the primary cultured cortical neuron cells,25 mg/L,50 mg/L ASS inhibited the activity of γ-secretase compared with control group,and,the effect of inhibition were enhanced as the concentration increased.The concentration of Aβ1-40was incresedand the expression of APP-N terminal fragment protein were decreased in APP695-CHO stably transfected cells,which all changes were alleviated by different dose of ASS.ConclusionASS could inhibit the activity of endogenousγ-secretase to decreasing Aβ1-40production and influence APP processing may have an protective effect on Alzheimer’s disease pathology.

Acanthopannx Senticousus Saponins；β-amyloid protein; γ-secretase; Alzheimer’s disease；APP-N terminal fragment

吉林省教育廳科學技術研究項目(吉教科合字2016-279號)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2173-04

R285

A

劉 芳(1990-)，女，碩士，研究方向為神經毒理學;許妍姬(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為神經毒理學。

2017-08-01)