熒光金納米簇/單壁碳納米管(AuNCs/SWNTs)復合材料制備及體外細胞毒性研究

李英姿，何 丹，汪德州，李迎彩，張 艷，劉 新，宋文植*，尹萬忠*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 口腔科，吉林 長春130033;2.吉林大學第一臨床醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科)

熒光金納米簇/單壁碳納米管(AuNCs/SWNTs)復合材料制備及體外細胞毒性研究

李英姿1，何 丹2，汪德州1，李迎彩1，張 艷1，劉 新1，宋文植1*，尹萬忠2*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 口腔科，吉林 長春130033;2.吉林大學第一臨床醫院 耳鼻咽喉-頭頸外科)

目的制備新型熒光金納米簇/單壁碳納米管(AuNCs/SWNTs)復合材料并研究其體外細胞毒性。方法以牛血清白蛋白介導合成金納米簇，并進一步合成AuNCs/SWNTs納米復合材料，檢測其熒光性，CCK-8方法檢測其對人成纖維細胞的體外細胞毒性。結果制備的AuNCs/SWNTs納米復合材料鏡下有明顯熒光，CCK-8結果顯示，不同濃度AuNCs/SWNT材料分別與細胞共同培養24 h,各劑量組與正常對照組相比較，細胞存活率差異不具有統計學意義(P>0.05)。結論制備的熒光AuNCs/SWNTs納米復合材料在本實驗濃度范圍內無體外細胞毒性，在腫瘤細胞成像及近紅外熱療領域有潛在應用前景。

單壁碳納米管;金納米簇;CCK-8;細胞毒性

碳納米材料的研究是當前世界上最為活躍的前沿領域之一，其中單壁碳納米管(SWNTs)是一種具有獨特層狀中空管狀結構的一維量子材料，具有巨大的比表面積和獨特的近紅外光吸收特性，易于修飾，在示蹤成像、靶向載藥、腫瘤熱療等領域具有引人注目的前景[1，2],其研究也正向多功能復合材料方向發展，因此本實驗擬制備新型熒光金納米簇/單壁碳納米管(AuNCs/SWCNTs)復合材料，并檢測其熒光性與體外細胞毒性，為此種材料的生物醫學應用提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及材料單壁碳納米管(SWNTs,中國科學院成都有機化學有限公司)；四 氯 金 酸(HAuCl4·3H2O,國藥集團化學試劑有限公司)，無水丙酮，氨水(國藥集團化學試劑有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS， Amresco，美國)，氫氧化鈉(NaOH,美國Sigma公司)，乙醇(C2H5OH北京化工廠)，以上均為優級純；高純水(Milli-Q純水儀,使用前減壓蒸餾提純)，PTFE濾膜(Millipor，美國)，DMEM培養基(GIBCO，美國)，牛血清白蛋白(BSA,GIBCO，美國)CCK-8試劑盒(日本同仁)胰蛋白酶(DIFCO，美國)胎牛血清(TBD公司 ，中國)。

實驗儀器： JEOL-2010透射電鏡(日本電子),二氧化碳孵箱(美國SIM公司)，超凈工作臺(安徽蚌埠市瑞風凈化設備)，JEM-2100F高分辨透射電鏡(日本電子) BX51熒光顯微鏡(日本，奧林巴斯)。

1.2方法

1.2.1熒光金納米簇單/壁碳納米管(AuNCs SWNTs/)納米復合粒子合成 參照文獻制備金納米簇(AuNCs)：以次氯金酸為原料，以牛血清白蛋白(BSA)介導合成BAS-AuNCs金納米簇材料[3]，反應完畢溶液從淺黃色到淺棕色，最后成為深棕色的BAS-AuNCs金納米簇溶液，4℃避光保存。

單壁碳納米管(SWNTs)的純化：將80 mg單壁碳納米管與2 g SDS混和于200 ml超純水中，冰水浴中超聲 30 min。將超聲后的混合物在4℃ 離心 4 h (12500 rpm/min)，棄沉淀。小心收集約80%的上清液， 并用無水丙酮稀釋,在此過程中,SDS從碳管上解離，使碳管發生絮凝聚集。 離心收集碳管，并用丙酮清洗數次以完全去除SDS，PTFE膜(0.45 μm)過濾，真空干燥。

取1 mg 純化后的單壁碳納米管加入1 ml BSA-AuNCs 溶液中，冰水浴中超聲2 h至碳管完全分散，4℃下靜止12 h。將此混合溶液以12 000 rpm /min離心 30 min，以除去未與碳管結合的BSA-AuNCs，棄上清液，超純水洗滌3次，得到AuNCs /SWNTs 納米復合粒子。鏡下觀察粒子形貌并檢測其熒光性，得到的AuNCs/SWNTs 納米復合粒子示意圖如圖1。

圖1 AuNCs/SWNTs納米復合粒子示意圖

1.2.2AuNCs/SWNTs納米復合粒子體外細胞毒

性檢測 取手術切除的兒童新鮮包皮組織，參考文獻[4]分離培養人成纖維細胞，傳代，取對數生長期的細胞，胰酶消化，將細胞密度調整為1×105/ml，96孔板內接種，二氧化碳培養箱37℃孵育，單層細胞鋪滿孔底后，棄培養液，將制備的熒光金納米簇/碳納米管復合粒子用含100 u/ ml 青霉素-鏈霉素的DMEM細胞培養液稀釋,每孔200 μl加入96孔板中，使6組SWNTs/AuNCs粒子終濃度分別為(0、6.25、12.5、25、50和100 μg/ml)，每組3復孔，空白對照組只加細胞培養液。繼續培養24 h，棄原培養液，每孔加入cck-8試劑10 μl及細胞培養液至100 μl，孵育2 h ，檢測各孔吸光度值，參比波長450 nm。各組細胞存活率按以下公式計算：

細胞存活率(%)= (A加藥-A空白)/(A無藥-A空白)×100% 。

A加藥：含細胞、CCK溶液和AuNCs/SWNTs納米粒子溶液孔的吸光度；A空白：含DMEM培養基和CCK 溶液孔的吸光度；A無藥：含細胞、DMEM培養基、CCK溶液孔的吸光度。

1.3統計學方法

實驗結果統計學分析采用SPSS17.0統計軟件處理，組與組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1AuNCsSWNTs/納米復合材料表面形貌

AuNCs SWNTs/ 納米復合粒子掃描電鏡及高分辨電鏡觀察見圖2。由圖可看出，單壁碳納米管能夠有效的被分散于BSA-AuNCs溶液中，高分辨電鏡下可見金納米簇粒子連接于碳納米管表面,形成復合納米材料。

圖2 金納米簇/碳納米管復合材料透射電鏡及高分辨電鏡圖

2.2AuNCs/SWNTs 納米復合材料熒光顯微鏡照片見圖3。由圖可見AuNCs/SWNTs 納米復合粒子熒光顯微鏡下鏡下仍有明顯熒光。

圖3 金納米簇/碳納米管復合材料熒光電鏡圖

2.3AuNCsSWNTs/納米復合材料熒光光譜

金納米簇/碳納米管復合材料熒光光譜見圖4。可見，當激發波長為470 nm時，熒光金納米簇/碳納米管復合材料最大發射波長在640 nm。

2.4AuNCs/SWNTs納米復合材料體外細胞毒性檢測

CCK-8法檢測不同濃度AuNCs/SWNTs納米復合材料對人成纖維細胞存活率的影響，結果見表1。

結果表明，不同濃度AuNCs/SWNTs分別與細胞共同培養，各濃度組與陰性對照組相比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 金納米簇/碳納米管復合材料熒光發射光譜

復合粒子濃度(μg/ml)06．2512．52550100細胞存活率(%)100±0100．086±2．94397．449±1．61298．765±0．33195．274±1．05294．523±1．873

3 討論

3.1單壁碳納米管及其復合材料在腫瘤診療領域的應用

單壁碳納米管(SWNTs)由單層石墨卷曲而成,直徑為1-2 nm,長度50 nm-1 cm。在腫瘤診療領域，單壁碳納米管因具有獨特的近紅外光學性能而成為惡性腫瘤光熱治療的理想介導材料[5]。同時因單壁碳納米管是柔韌的一維結構，具有非常大的比表面積,因此易于修飾，可以同時裝載多個分子，利于制備多功能納米材料及生物傳感材料，并可與一個細胞上的多個結合位點結合，因此在腫瘤診療領域展現出有價值的應用前景。具體來說有以下幾個方面：

3.1.1生物傳感器用于腫瘤早期診斷

單壁碳納米管具有納米尺度、石墨烯式的表面化學和電學性質,使其成為理想的制作化學與生物傳感器的候選材料[6,7]。應用半乳糖修飾的單壁碳納米管為生物傳感器元件檢測腫瘤細胞表面標記物半乳糖凝集素3[8]，Liu[9]等用葉酸共價修飾的單壁碳納米管組裝至3-巰基丙酸(MPA)修飾的金基板負極，利用葉酸與細胞表面葉酸受體的高親和比率檢測人宮頸癌細胞，大大提高了宮頸癌早期檢測精確度。目前研究認為應用單壁碳納米管制作無標記電化學阻抗譜(EIS)生物傳感器可以降低生物傳感芯片背景信號，增加靈敏度，有望用于腫瘤相關糖蛋白的高通量，非標記質譜技術檢測，在腫瘤早期診斷中發揮重要作用。

3.1.2藥物載體

單壁碳納米管能夠與多種蛋白質、核酸、化學藥物等有機或無機粒子結合，成為理想載體材料。以基因藥物載體為例，傳統的病毒等載體通過將核酸導入細胞質或細胞核內發揮治療作用,Behnam等[10]將單壁碳納米管與不同分子量的聚乙烯亞胺(PEIs)相連，證明聚乙烯亞胺修飾的單壁碳納米管在體液環境下有良好的分散型及穩定性，體內體外都展示出高效的基因轉染效率。Kam等[11]將PL-PEG修飾單壁碳納米管,并通過二硫鍵與SiRNA相連,達到使目的基因沉默的目的。研究證明碳納米管作為一種新型非病毒基因藥物載體,與傳統的核酸轉運載體相比,己經表現出其獨特的優勢[12,13]。在惡性腫瘤化療領域，化療藥物不僅有很強毒副作用,而且易產生耐藥性影響治療效果。Ajima[14]等以抗癌藥物順鉑與單壁碳納米管相連制備出納米藥物載體CDDP@SWNHox ，體外實驗顯示CDDP@SWNHox抑制腫瘤細胞增殖的作用較單純的CDDP高4-6倍， 體內實驗也較CDDP顯示出更強的抑瘤作用。Bhirde等[15]針對膜高表達CD44的多藥耐藥細胞，開發出新型單壁碳納米管復合藥物輸送系統CAHA-sSWCNT-DOX，證明此種藥物復合載體可使抗癌藥物DOX分子更多地聚集于癌細胞內，從而更有效地殺滅多藥耐藥卵巢癌細胞CAHA-sSWCNT-DOX，靜脈注射的CAHA-sSWCNT-DOX結合808 nm激光熱療，可以使多藥耐藥卵巢癌OVCAR8/ADR細胞荷瘤裸鼠的腫瘤完全消失。Lin[16]等則制備了負載化療藥物阿霉素和磁共振增強劑的納米復合材料Gd/SWCNTs-HA-ss-DOX，使化療、光熱治療和磁共振成像功能集于一個納米平臺成為可能。

因此目前認為利用功能化碳納米管作為藥物和基因輸送載體，具有轉染效率高、減輕毒副反應、可有效作用于多藥耐藥細胞、實現藥物控釋和協同治療等優點。

3.1.3成像及近紅外光熱治療

700-1 100 nm范圍的近紅外光區是機體組織的透射窗口，而SWNTs有高吸收此范圍光波的特性,因此SWNTs在受到近紅外激光照射時可以快速產生光熱轉換，使腫瘤局部溫度升高而達到有效溫度42-45℃而不傷害周圍健康細胞[17,18]。腫瘤細胞的近紅外熱療有兩種殺滅方式：熱消融或誘導瘤細胞凋亡，一般認為是在多種機制共同作用下達到殺滅腫瘤細胞的效果。此外，因為SWNTs具有較大的散射截面,故具有了獨特的拉曼信號增強功能[19,20],可用于拉曼探測和成像,在惡性腫瘤早期診斷、治療監測中有重要意義。目前將SWNTs腫瘤靶向給藥系統和近紅外激光熱療聯合應用可以達到更加有效的抗腫瘤作用。

3.2熒光金納米簇/單壁碳納米管復合材料的制備

由單壁碳納米管和熒光物質共同組成的復合納米材料在腫瘤多模態生物成像、光學傳感等方面具有尤為重要的意義[21]。單壁碳納米管熒光復合材料一般是通過共價結合的方式將熒光染料、半導體量子點等連接到碳納米管表面。此類方法通常需要進行多步修飾，時間成本和經濟成本較高。并且，熒光染料和半導體量子點在光穩定性和生物相容性等方面的不足限制了此類復合材料在生物和醫學等領域的應用。

金納米簇是近年來新發展起來的一類熒光材料[22,23]。與經典的熒光染料和半導體量子點相比，金納米簇具有更好的光穩定性和生物相容性。金納米簇的合成通常采用生物分子，如氨基酸、蛋白質、DNA等作為配體。一方面，這些配體分子能夠給金納米簇提供足夠的保護作用，避免納米簇在溶液中的聚集。另一方面，這些配體具有豐富的功能集團，為金納米簇和其他材料的復合提供可能。因此本文中，我們利用牛血清白蛋白為配體制備金納米簇，疏水性的單壁碳納米管可以很好地分散于牛血清白蛋白/金納米簇溶液中，并以非共價結合的方式結合，得到新型單壁碳納米管/金納米簇熒光復合材料，本實驗中制備的金納米簇/單壁碳納米管材料分散性好且穩定，可以4℃保存1周而無沉淀，使驗中牛血清白蛋白的存在防止了碳納米管的熒光淬滅作用，使新型單壁碳納米管/金納米簇材料繼續保持其良好的熒光性。

3.3熒光金納米簇/單壁碳納米管復合材料的生物相容性

一般認為疏水性的碳納米管經過表面修飾后不僅增加其可溶性，而且可大大降低其細胞毒性，使之更加符合生物醫學領域要求[24,25]。本實驗以新型牛血清白蛋白/金納米簇修飾單壁碳納米管，不僅增加了其可溶性，而且采用簡便準確的CCK-8方法研究其體外細胞毒性，從實驗結果看，本實驗條件下，各組不同濃度熒光金納米簇/碳納米管復合材料體外細胞毒性均為0-1級，說明此濃度范圍的AuNCs/SWNTs納米復合材料對人成纖維細胞無體外細胞毒性。可以認為經BSA-AUNCs功能化修飾的單壁碳納米管更適于生物醫學領域應用的要求。

因此本實驗制備的熒光金納米簇/碳納米管復合材料結合了單壁碳納米管的近紅外光熱轉換功能和金納米簇熒光性為一體，且在一定濃度范圍內無體外細胞毒性，不僅可用于近紅外熱療、成像診斷，而且后續還可望作為載體材料負載化療、光動力治療等藥物，將在惡性腫瘤綜合診療領域有廣范應用。

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國家自然科學基金項目(81372900);吉林省科技廳項目(201401010 55JC,20110708);吉林大學2014年交叉創新擇優資助項目

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2180-05

R780.1

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2017-01-17)