衛氣虛相關血漿代謝標志物的季節性變化研究

閆翠環，王亞利，王鑫國，張明泉，劉湘，李博林，曹文利

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050017；3.河北省中醫院，河北 石家莊 050011

衛氣虛相關血漿代謝標志物的季節性變化研究

閆翠環1，王亞利2，王鑫國1，張明泉1，劉湘3，李博林3，曹文利1

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050017；3.河北省中醫院，河北 石家莊 050011

目的 觀察春、夏、秋、冬不同季節衛氣虛證SD大鼠的血漿代謝組學特征，尋找與衛氣虛相關的物質基礎，探討衛氣虛的本質。方法 分別于春分日、夏至日、秋分日、冬至日前7 d適應性喂養SD雄性大鼠各20只，與各季節氣候同步控制條件，按隨機數字法將大鼠分為實驗組和對照組。實驗組通過疲勞加寒熱交替法復制衛氣虛大鼠模型。于各節氣當日12:00取血，采用高效液相色譜-質譜聯用儀檢測血漿代謝物，通過偏最小二乘判別分析對數據進行統計分析，比較各季節實驗組和對照組的數據和圖譜，探尋體現組間差異的代謝物，推測與衛氣虛相關的生物標志物。結果 在春、夏、秋、冬不同的季節中，各實驗組和對照組大鼠間代謝譜呈現明顯差異。在4組比較中，同型半胱氨酸在春、夏、秋季實驗組與對照組比較差異顯著，神經酰胺在夏、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，睪酮在春、夏季實驗組與對照組比較差異顯著，環鳥甘酸在秋、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，肌氨酸在春、夏、冬季實驗組與對照組比較差異顯著，這些物質的生理功能涉及機體的脂代謝、氨基酸代謝、神經遞質以及激素水平的調節。結論 伴隨季節變化，衛氣虛的生物標志物也發生相應變化，主要體現在氨基酸代謝、脂類代謝、神經遞質以及激素調節水平等方面。

衛氣虛；代謝組學；季節變化；生物標志物；大鼠

《靈樞?禁服》有“審察衛氣，為百病母”，衛氣功能失常是多種疾病的主要病機，衛氣的溫養、固護肌表和抗御外邪功能失常可導致汗證、痹證、失眠或多寐、善忘、癰疽腫瘍等多種疾病的發生。關于衛氣虛的實質，有學者從白細胞相關抗原的角度認為人類白細胞抗原-DR4是衛氣虛人群對外感疾病易感的免疫遺傳學基礎[1]；或認為衛氣虛與機體黏膜免疫及神經-內分泌-免疫網絡相關[2-3]。本課題組前期研究表明，衛氣虛證周期性變化可能與能量代謝密切相關，同時還伴隨著細胞、激素及神經調節[4]；衛氣及衛氣虛的季節變化與淋巴細胞生物鐘基因Clock密切相關[5]。衛氣虛的實質研究為衛氣虛相關疾病的預防、治療及療效判定提供了客觀依據，但仍未達成統一的意見。本實驗利用代謝組學技術，從生物標志物的角度觀察衛氣虛證在不同季節的血漿代謝組學變化，進一步探討衛氣虛的本質。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD大鼠80只，SPF級，6～8周齡，體質量（180±30）g，河北醫科大學實驗動物中心，動物合格證號1309031、1312049、1403037、1406027。飼養于光照周期12 h/12 h的環境中。

1.2 主要試劑與儀器

乙酸、乙酸銨均為色譜純，Dikmapure（中國）公司；乙腈、甲醇均為色譜純，美國Fisher Scientific公司；蒸餾水，屈臣氏公司；其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀（ULTRIP-LC-100），美國AB公司；色譜柱，美國phenomenex公司，型號Hypersil Golda Q C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司，型號TGL-16M；超低溫保存箱，日本三洋公司，型號MDF-382E。

2 實驗方法

2.1 造模和分組

大鼠適應性飼養1周后進行實驗。通過疲勞加寒熱交替法制造衛氣虛大鼠模型[6]。將大鼠置于20 ℃水中游泳約30 min，常規條件飼養30 min后，放入恒溫箱（40±1）℃中15 min進行熱刺激，密切關注大鼠變化，每5 min觀察1次，造成玄府開泄、衛表不固。大鼠取出后，常規條件飼養30 min，再放入-20 ℃冰箱10 min進行冷刺激，密切關注大鼠變化，每2 min觀察1次。每只大鼠每日9:00疲勞加寒熱刺激1次，連續7 d。大鼠癥狀表現：扎堆、蜷縮、發抖，被毛凌亂，汗出明顯，出現鼻腔分泌物，活動減少，輕度腹瀉等；血常規檢查白細胞計數升高。符合以上表現為造模成功[7-8]。按隨機數字法將大鼠分為春分實驗組、對照組，夏至實驗組、對照組，秋分實驗組、對照組，冬至實驗組、對照組，每組10只。對照組常規飼養，不做任何干預。

2.2 取樣

大鼠分別于春分（2014-03-21）、夏至（2014-06-21）、秋分（2013-09-23）、冬至（2013-12-22）當日12:00取血，肝素鈉抗凝，3500 r/min離心10 min，上清液移至凍存管-80 ℃保存。

2.3 血漿樣本預處理

2.3.1 檢測樣品制備 乙腈、蒸餾水4 ℃過夜預冷。按乙腈/水（3∶1）混合液沉淀蛋白，混勻，14 000 r/min離心10 min；取上清液，按1∶1比例加入蒸餾水稀釋，14 000 r/min離心10 min，移上清液入液相加樣瓶中待測。

2.3.2 質量控制樣本制備 各組血漿樣品4 ℃復融，分別取10 μL血清，渦旋震蕩混勻，按每管100 μL分裝于EP管中，即為質量控制樣本（QC），其余處理同檢測樣品處理方法。

2.4 HPLC-MS檢測

應用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple 4500 System檢測和采集數據。色譜條件：流動相A溶劑為水（0.05%乙酸，2 mmol乙酸銨溶液），B溶劑為乙腈（0.05%乙酸，2 mmol乙酸銨溶液）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。質譜條件：采用正離子（ESI+）模式檢測；質荷比（m/z）50～850 Da；Curtain Gas：30 psi；Gas1：55 psi；Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 統計分析

3.1 數據預處理

利用Markerview1.2.1代謝組學分析軟件將數據進行預處理，包括數據格式轉換、導入；圖譜查看、對比（TIC、2D、3D、MS）；去噪音；提取質譜峰；反卷積處理；峰排列、對齊、合并；列表去噪音；縫隙填補處理；數據導出獲得二維數據陣。

3.2 數據分析

采用SIMCA13.0.3統計軟件進行多變量分析，采用偏最小二乘判別分析（PLS-DA），結合代謝組學分富馬酸二甲酯、膽固醇酯、神經酰胺、肌氨酸、環鳥甘酸5種差異代謝物為冬季衛氣虛可能標志物（見表4）。同型半胱氨酸在春、夏、秋季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，神經酰胺在夏、冬季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，睪酮在春、夏季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，環鳥甘酸在秋、冬季實驗組與對照組差異性比較中顯著表達，肌氨酸在春、夏、冬季的實驗組與對照組差異性比較中顯著表達。

表1 春分實驗組與對照組差異代謝標志物

表2 夏至實驗組與對照組差異代謝標志物

表3 秋分實驗組與對照組差異代謝標志物

表4 冬至實驗組與對照組差異代謝標志物

5 討論

衛氣虛是機體衛外不足，肌表失于固護，易于感受外邪的一種病機，容易導致表虛證。《內經》通過“天溫日明，則人血淖澤而衛氣浮，故血易瀉，氣易行；天寒日陰，則人血凝泣而衛氣沉”指出衛氣隨季節變化的特征。以此推測以衛氣生理功能失常為主要表現的衛氣虛證也應該存在季節性變化特征。代謝組學描述的是生物體的內源性代謝小分子隨時間變化而形成的代謝圖譜，具有即時性和動態性特征。所以，代謝組學技術有助于客觀認知衛氣虛的生物學本質。若能確定衛氣虛的生物標志物，則有助于進行辨證施治的療效評價，并結合機體內源性生物標志物的軌跡變化，確定中藥藥效的物質基礎。這也是“中醫方證代謝組學”的觀點[9]，通過代謝組學技術的利用，為中醫辨證和療效判定提供量化的客觀依據。

本實驗結果顯示，同型半胱氨酸、富馬酸二甲酯、睪酮、神經酰胺、膽固醇酯、環鳥甘酸、肌氨酸等物質在實驗組和對照組間呈現明顯差異，這些物質的功能涉及機體的脂代謝、氨基酸代謝、神經遞質及激素水平的調節。同型半胱氨酸由肌肉、肝臟等組織蛋氨酸脫甲基生成，靠自身代謝的動態平衡調節濃度。當其濃度異常時可成為“毒性氨基酸”，導致甲硫氨酸循環發生紊亂，可使多個基因的甲基化狀態發生改變，進而影響其表達[10-11]。肌氨酸又名N-甲基甘氨酸，由S-腺苷酶的一組甲基轉移到甘氨酸后生成，是膽堿代謝成為甘氨酸過程中的一個非編碼氨基酸中間體，存在于人體的肌肉和一些其他組織中，其生成過程中需要的甘氨酸-N-甲基轉移酶主要表達在前列腺和其他組織[12]。肌氨酸轉變成的甘氨酸是結構性氨基酸，是肌酸、嘌呤、谷胱甘肽等活細胞必需成分的代謝來源，在人體生理活動中具有重要作用。L-谷氨酰胺是人體肌肉中最豐富的游離氨基酸[13]，一方面能促進蛋白質的合成，參與保持谷胱甘肽儲備，保護組織細胞避免受到氧自由基帶來的損傷[14]，提高機體對應激的適應性；對于營養不良的個體，谷氨酰胺還通過提供能量ATP到巨噬細胞，調節巨噬細胞的分泌功能，也有認為谷氨酰胺能增強機體的體液免疫[15]。腦苷脂是廣泛存在于生物細胞膜中的一類重要活性脂質，具有免疫調節、改善脂質代謝等多種生物活性[16-18]，其主要結構單元即糖基和神經酰胺，后者是細胞膜的重要組成成分，是神經鞘脂類的骨架結構。同時，神經酰胺可以作為第二信使，參與膜的信號傳導[19]，在細胞的分化、增殖、衰老和凋亡過程中發揮良性調節作用[20-21]。N-乙酰天門冬氨酸存在于機體的正常神經元內，普遍存在于神經細胞胞體和神經軸突中，發揮營養神經的功能，并沿軸索傳遞信號[22]。睪酮的分泌主要受下丘腦-腺垂體-性腺軸調節，同時可以將信息反饋至調節軸，形成循環以維持體內性激素分泌的平衡。睪酮能夠增加骨骼肌細胞膜對氨基酸的攝取、促進核酸、肌蛋白、紅細胞和磷酸肌酸的生成，與機體的體質和運動能力密切相關。

在春、夏、秋、冬季節差異性表達的代謝物中，同型半胱氨酸、肌氨酸、神經酰胺、睪酮、環鳥甘酸分別在2個以上不同季節的實驗組與對照組比較中發揮作用，尤其是同型半胱氨酸和肌氨酸分別在3個季節的實驗組和對照組差異性比較中發揮作用，其對衛氣和衛氣的生理功能影響幾乎持續四季，說明衛氣虛的季節性變化與氨基酸代謝關系尤為密切，這也與本課題組前期研究中反復上呼吸道感染肺衛氣虛證的潛在標志物多為氨基酸類的研究結果一致[23]。

綜上所述，衛氣虛的病理狀況涉及機體氨基酸、脂類、神經遞質、激素4個層面的代謝標志物變化。我們推測機體衛外功能的異常，即衛氣虛狀況的出現，與機體氨基酸、脂類代謝有關，也和機體神經調節以及激素調節密切相關，從代謝組學角度分析機體內源性生物標志物的細微變化，可以在早期通過量化指標確定衛氣虛證，從而達到未病先防或既病防變的目的。

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（修回日期：2016-08-05；編輯：華強）

Research on Seasonal Variation of Plasma Metabolic Markers of Wei-qi Deficiency

YAN Cui-huan1,

WANG Ya-li2, WANG Xin-guo1, ZHANG Ming-quan1, LIU Xiang3, LI Bo-lin3, CAO Wen-li1(1. Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China; 2. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 3. Hebei Province Chinese Medicine Hospital, Shijiazhuang 050011, China)

Objective To study the plasma metabolomics features of SD rats with wei-qi deficiency respectively in spring, summer, autumn and winter; To seek the potential markers related to wei-qi deficiency; To discuss the essence of wei-qi deficiency. Methods Twenty male SD rats were adaptively fed 7 days before Chinese Vernal Equinox Day, Summer Solstice, Autumn Equinox and Winter Solstice, synchronous controled with temporal condition. The rats were randomly divided into experimental and control groups according to random number method. Rats in the experimental groupwere made into wei-qi deficiency models through fatigue stimulation alternately with cold and heat stimulation. Blood was collected at 12:00 each solar term. High performance liquid chromatographymass spectrometry instrument was used to detect plasma metabolites. Partial least squates-discriminant analysis was used to process statistical analysis of the data to compared the original data of plasma metabolomics between the two groups of each season, and explore the difference metabolic markers between each two groups, then speculate the potential biomakers of wei-qi differency. Results With the changes of spring, summer, autumn and winter, significant differences were showed in metabolic profile between the experimental and control groups. Homocysteine showed a significant difference in spring, summer and autumn; Ceramide showed a significant difference in summer and winter; Testosterone showed a significant difference in spring and summer; Cyclic guanosine monophosphate showed a significant difference in autumn and winter; Sarcosine showed a significant difference in spring, summer and winter. The physiological functions of these substances related to lipid metabolism, amino acid metabolism, neurotransmitter and hormone regulation. Conclusion Potential biomakers of wei-qi deficiency changed along with the seasonalvariation, which mainly reflected in lipid metabolism, amino acid metabolism, neurotransmitter and hormone regulation. Key words: wei-qi deficiency; metabolomics; seasonal variation; biomarker; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.017

R228

A

1005-5304(2017)01-0066-05

2016-07-05）