苦參總生物堿脂質體凝膠的制備及釋藥機制研究

朱泠音，鄭觀濤，周昌妮，申延利，韓志芳，賈永艷

河南中醫學院藥學院，河南 鄭州 450046

苦參總生物堿脂質體凝膠的制備及釋藥機制研究

朱泠音，鄭觀濤，周昌妮，申延利，韓志芳，賈永艷

河南中醫學院藥學院，河南 鄭州 450046

目的 優化苦參總生物堿脂質體的處方與工藝，制備苦參總生物堿脂質體凝膠并研究其釋放機制。方法 運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質體，以包封率和載藥量為考察指標，采用酸性染料比色法測定脂質體中苦參堿含量。采用正交試驗設計對處方工藝進行優化，選出最優處方制備脂質體。以泊洛沙姆-407為基質，制備苦參總生物堿脂質體凝膠。考察藥物凝膠與藥物脂質體凝膠的透皮速率。結果 通過優化處方與工藝所得的脂質體形態均勻，粒徑范圍為100～400 nm，包封率達74%，載藥量達26%。所制備的脂質體凝膠呈透明狀半固體。體外釋放結果顯示，苦參堿凝膠48 h內累積釋藥量為6.34 mg/cm2，苦參總生物堿脂質體凝膠48 h內累積釋藥量為6.97 mg/cm2，后者的累積透皮量、穩態透皮速率及48 h后在皮膚中的蓄積量均較前者顯著提高。結論 優化的制備工藝穩定可行，制得的苦參總生物堿脂質體凝膠質量較好，可有效延緩藥物的釋放速率，提高藥物在體內的蓄積量。

苦參總生物堿；脂質體；凝膠

苦參總生物堿是苦參、山豆根的主要活性成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒殺蟲等藥理活性，制成凝膠涂于黏膜能夠用于各種炎癥性婦科疾病的治療[1]。脂質體凝膠是由磷脂、膽固醇及泊洛沙姆-407組成的載藥量大、包封率高的藥物載體，可增加藥物在皮膚滯留時間，有效地將藥物通過角質層運送至皮膚更深層或血液循環，適合作為外用給藥和經皮給藥的載體。為進一步提高藥物的治療效果，充分發揮藥效，本研究運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質體，采用正交試驗設計對處方工藝進行優化。通過綜合考察指標，選出制備苦參總生物堿脂質體的最優處方。以泊洛沙姆-407為凝膠基質[2]，制備苦參總生物堿脂質體凝膠。通過酸性染料比色法測定脂質體及凝膠中苦參總生物堿含量，運用Franz擴散池對其不同釋藥基質的透皮速率進行研究。

1 儀器、試藥與動物

RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DV超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），J2-MC高速低溫離心機（美國Beckman），T6新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），BSA124S型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司），PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠），渦旋混合儀（美國Scientific Industries），NanoZS90型粒徑儀（馬爾文儀器），YB-P6智能透皮試驗儀（天津市弗蘭斯電子科貿有限公司）。

苦參堿對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號120519，純度≥98%），卵磷脂（天津市光復精細化工研究所），膽固醇（北京雙旋微生物培養基制品廠），泊洛沙姆-407（P407，美國BASF公司，批號50011254），無水乙醇（天津市恒興化學試劑制造有限公司），溴麝香草酚藍（天津市致遠化學試劑有限公司，稱取0.025 g，溶于pH 7.6緩沖液200 mL中，制成溴麝香草酚藍緩沖液[3]）；苦參（河南中原正信藥材有限公司，產地河南，批號20110115）；氯仿（天津市四友精細化學品有限公司），甲醇（天津市四友精細化學品有限公司），其他試劑均為國產分析純。

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質量（20±2）g，3周齡，河南省實驗動物中心，合格證號41003100001652。

2 方法與結果

2.1 苦參總生物堿的制備

取苦參飲片，用8倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，減壓濃縮，過濾，過SP825大孔吸附樹脂柱，用水洗滌，水洗液棄去，50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏，減壓干燥，即得苦參總生物堿提取物，備用。

2.2 苦參總生物堿脂質體的制備

運用薄膜分散法制備苦參總生物堿脂質體。稱取卵磷脂和膽固醇適量，加入15 mL無水乙醇，超聲溶解后，在旋轉蒸發儀上45 ℃、轉速5級，除去乙醇溶劑，使卵磷脂和膽固醇的混合物在瓶壁上形成透明均勻的薄膜層。另取適量苦參總生物堿，加pH 6.8磷酸鹽緩沖液30 mL，超聲溶解后倒入旋轉蒸發瓶中，40 ℃攪拌水化一定時間，功率100 W水浴超聲10 min，即得乳白色偏黃的苦參總生物堿脂質體混懸液。

2.3 包封率、載藥量的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密量取苦參堿對照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.3.2 檢測波長的確定 取對照品溶液20 μL，置20 mL具塞試管中，用酸性染料比色法（加氯仿6 mL、溴麝香草酚藍緩沖液6 mL，劇烈振搖2 min后轉移至分液漏斗，靜置1 h，分取下層氯仿層）萃取，將氯仿溶液進行全波長掃描。取苦參總生物堿樣品及氯仿適量，同法操作。結果表明，溴代麝香草酚藍和苦參堿形成的離子對復合物在413 nm波長處有最大的吸收峰，空白處則無吸收，故選擇413 nm為苦參總生物堿的測定波長。

2.3.3 標準曲線與線性范圍 取“2.3.1”項下對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，可得濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的苦參堿對照品溶液，分別量取0.5 mL上述溶液置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染色法測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝2.907 5X＋0.068 1（r2＝0.999 6）。表明苦參堿在0.04～0.20 mg/mL范圍內與其吸光度線性關系良好。苦參總生物堿含量以苦參堿含量計。

2.3.4 樣品測定 通過高速離心方法分離游離的苦參總生物堿與苦參總生物堿脂質體。吸取苦參總生物堿脂質體混懸液3 mL，置于超濾離心管中，7500 r/min[4]高速離心30 min，精密量取濾液1 mL置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，代入標準曲線計算游離藥物量（W）。精密吸取0.15 mL脂質體混懸液置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，放置1 d破乳后，精密量取上層清液1 mL置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度。代入標準曲線計算脂質體混懸液中總藥物量（M）。按下列公式計算包封率和載藥量。

2.3.5 精密度考察 精密吸取同一破乳后的苦參總生物堿脂質體溶液5份，每份1 mL，置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，計算樣品含量，RSD＝1.98%，表明精密度良好。

2.3.6 穩定性考察 精密吸取破乳后苦參總生物堿脂質體溶液1 mL，置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法分別在制備后0、10、20、30 min測定吸光度，結果RSD＝2.04%，表明苦參總生物堿脂質體溶液在30 min內穩定。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密吸取6份破乳后的苦參總生物堿脂質體溶液0.5 mL，加入苦參堿對照品溶液0.5 mL（濃度32.5 μg/mL），置20 mL具塞試管中，以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染料比色法測定吸光度，計算平均回收率為105.91%，RSD＝3.07%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.4 脂質體的處方與工藝優化

根據預試驗結果及相關參考文獻[4]，以脂質體載藥量、包封率兩者綜合作為指標，將對脂質體載藥量和包封率有顯著影響的磷脂與膽固醇摩爾比（A）、磷脂與藥物的質量比（B）、水化時間（C）作為考察因素，設計三因素四水平正交試驗，對脂質體的制備工藝進行優化[5]，因素水平見表2，試驗結果見表3、表4，方差分析見表5。由試驗結果可知，影響脂質體包封率和載藥量綜合考察因素順序為：磷脂與膽固醇摩爾比（A）＞水化時間（C）＞磷脂與藥物的質量比（B），而影響脂質體包封率和載藥量綜合考察因素中，A的影響最大，其次是C，因此優化的處方和工藝為A2B3C2。可以得出磷脂與膽固醇的摩爾比為2∶1，水化時間為2 h，磷脂與藥物質量比為12∶1，此時苦參堿脂質體的包封率和載藥量綜合評分最高。在此工藝條件下，制得的脂質體粒徑分布范圍窄，粒徑均勻。

表2 正交試驗因素水平表

表3 苦參總生物堿脂質體的包封率及載藥量（%）

表4 正交試驗安排與結果

表5 正交試驗結果方差分析

2.5 苦參總生物堿脂質體凝膠與苦參總生物堿凝膠的制備

稱取10 mL苦參總生物堿脂質體混懸液，加入2.5 g泊洛沙姆-407，放置于4 ℃冰箱內24 h，使其充分溶脹，制得苦參總生物堿脂質體凝膠劑[6]。稱取22.7 mg苦參總生物堿，同法制備苦參總生物堿凝膠劑。

2.6 苦參總生物堿2種釋藥基質研究

2.6.1 離體鼠皮的制備 斷頸法處死小鼠，剔除腹部毛后剝取其皮膚，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈，泡于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存，24 h內使用。

2.6.2 擴散池條件 Franz擴散池透皮面積為2.8 cm2，接收池體積為18 mL，磁力攪拌速度為400 r/min，（37±1）℃恒溫水浴，接收液為磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，稱取磷酸氫二鈉4.369 3 g和磷酸二氫鈉1.216 9 g置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻，即得）。

2.6.3 體外透皮試驗 將預處理好的小鼠皮膚固定在擴散池與接收池之間，角質層朝向供給池，接收液液面恰好與皮膚的下層接觸，要求接收液與皮膚之間沒有氣泡。平行做2份，每份給藥分別為0.5 g苦參總生物堿脂質體凝膠、0.5 g苦參堿凝膠。開動電磁攪拌器和恒溫水浴，并保持速度為400 r/min、溫度37 ℃，分別于0.5、1、2、3、4、6、10.5、20、24、48 h將接收液全部取出（同時補充同溫、新鮮接收液）[7]。以氯仿為空白，用“2.3.2”項下酸性染色法測定吸光度，代入標準曲線，計算得苦參總生物堿的濃度（Ci），擴散池透皮面積為S，可求得其單位面積的累積釋放量（Q）。Q＝∑Qi?S－1（i＝0.5、1、2、3、4、6、10.5、20、24、48 h）。

將透皮吸收0.5～48 h所得累積釋放量Q、待釋放量對數Ln（100－Q）及累積釋放量對數LnQ與時間t、t1/2、Lnt分別按零級、一級、Higuchi和Ritger-Peppas方程處理，初步研究藥物的體外釋藥類型[8]。

結果表明，將數據進行模型擬合，苦參堿2種凝膠釋放擬合Ritger-Peppas模型較其他模型優勢明顯。苦參堿脂質體凝膠劑：LnQ＝0.667Lnt＋0.074，r2＝0.902，k＝1.95；苦參堿凝膠劑：LnQ＝0.553Lnt＋0.197，r2＝0.937，k＝1.74。說明苦參總生物堿2種凝膠在體內的釋藥均遵循Ritger-Peppas釋放。苦參總生物堿脂質體凝膠劑與苦參堿凝膠劑相比，在促進藥物透過皮膚角質層及皮膚蓄積方面具有顯著效果[9]。苦參總生物堿凝膠平均累積蓄積量為0.96 mg，苦參總生物堿脂質體凝膠平均累積蓄積量為1.95 mg，透皮釋放曲線見圖1。

圖1 苦參總生物堿2種凝膠的透皮釋放曲線

3 討論

本研究通過正交試驗設計優化苦參總生物堿脂質體的處方和工藝為：磷脂與膽固醇摩爾比為2∶1，水化時間為2 h，磷脂與藥物質量比為12∶1。優化工藝條件下制備的苦參總生物堿脂質體大小均勻，包封率和載藥量均較高。

在預試驗中，測量發現苦參堿在198 nm波長處也有最大吸收，但其溶劑磷酸鹽緩沖液在此波長附近有一定吸收，測量時會產生很大程度的干擾，且測量區域位于遠紫外區，對紫外測定條件非常不利[10]。運用液相進樣測定苦參堿耗時較長，經查閱文獻，可用酸性染料比色法測定苦參堿的含量[3]，確定413 nm為測定波長，結果令人滿意。試驗過程中，樣品加入氯仿及pH 7.6溴麝香草酚藍緩沖液后，需要充分振搖，使萃取完全，從而使苦參堿和染色劑形成的離子對轉移到有機溶劑中。結果表明，選用酸性染料比色法簡便、準確、專屬性強，具有良好的線性關系，本方法可用于苦參總生物堿脂質體的處方優化、含量測定、質量控制[11]。

在正交試驗前，對因素A、B、C進行了單因素考查，結果表明B中因素12∶1與15∶1無明顯差異，且相對于其他因素，對苦參總生物堿脂質體處方與工藝優化的結果不具有明顯的意義。因此，雖然12∶1已達到該因素的水平上限，為節約成本，提高載藥量，仍決定選用12∶1作為最優方案。

結果表明，脂質體能促進苦參總生物堿透過皮膚，與普通凝膠相比，其累積透皮量、穩態透皮速率及48 h后在皮膚中的蓄積量都有顯著提高。這種優勢可以使苦參總生物堿脂質體凝膠應用于臨床時，既避免了口服制劑的全身不良反應，提高局部藥物濃度，透皮效果又高于普通凝膠。本試驗為苦參總生物堿脂質體的體內研究奠定了基礎。

粒徑小于200 nm的脂質體較容易透過皮膚[12]，本試驗制得的脂質體粒徑為158.6 nm，不影響苦參總生物堿脂質體凝膠的透皮效果。苦參總生物堿脂質體凝膠是一個值得研究且用途廣泛的藥物。

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[6] 郭咸希,何楊虎,何文,等.尼美舒利脂質體凝膠的研制及體外經皮滲透動力學考察[J].中國藥學雜志,2008,43(1)：35-39.

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Release Mechanism and Preparation of Liposome Gel of Total Alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix

ZHU Ling-yin, ZHENG Guan-tao, ZHOU Chang-ni, SHEN Yan-li, HAN Zhi-fang,

JIA Yong-yan (College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

Objective To optimize the formulation and process of liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix; To prepare the liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix and study its release mechanism. Methods Matrine liposomes was prepared by using film dispersion method; With entrapment efficiency and medicine loading as indexes, acid dye colorimetric method was used for the determination of matrine content in liposomes. Orthogonal design was used to optimize the formulation and the optimal formulation of liposomes was selected. Poloxamer-407 was set as the substrate preparation of matrine liposome gel. The transdermal rate of medicine gel and medicine liposome gel was investigated. Results Obtained through formulation and technology optimization of liposomes formation uniform, particle size was in the range of 100 nm to 400 nm, entrapment 74%, loading 26%. Preparation of liposome gel was transparent semisolid. In vitro results showed, cumulative release dose of matrine hydrogel was 6.34 mg/cm2within 48 h; cumulative release doses of liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix was 6.97 mg/cm2within 48 h; cumulative volume, steady-state penetration rate through skin and 48 h volume in the skin of the latter were significantly improved compared with that of the former. Conclusion Optimum preparation is reliable and practical. Liposome gel of total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix made by the preparation is with high quality, which can effectively delay the medicine release rate, increase the volume of medicine in human body.

total alkaloids of Sophoras Flavescentis Radix; liposomes; gel

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.019

R283.5

A

1005-5304(2017)01-0077-05

2015-12-16）

（

2016-03-21；編輯：陳靜）

河南中醫學院藥學院大學生創新學習項目[YXCX（2014）23]

賈永艷，E-mail：hnzyjyy@126.com