人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應用

劉文寬，游愛萍，許 多，邱淑燕，周志超，李 熾，周 榮

(呼吸疾病國家重點實驗室，廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州醫科大學，廣東 廣州 510230)

人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應用

劉文寬，游愛萍，許 多，邱淑燕，周志超，李 熾，周 榮

(呼吸疾病國家重點實驗室，廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州醫科大學，廣東 廣州 510230)

人博卡病毒1型(human bocavirus 1，HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒，其研究尚處于初期階段。通過原核表達的方式對HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進行蛋白表達，通過純化、免疫小鼠成功獲得3種蛋白的抗體血清，通過ELISA評價了抗體對相應蛋白抗原及臨床HBoV1陽性樣品的效價，并將所制備的抗體成功用于HBoV1廣州株GU338055反向遺傳系統的NS1、NP1、VP1/2的免疫熒光研究。結果表明，所制備抗體在1∶50稀釋度時A450值對陰性對照約有4倍提升，為HBoV1后續深入研究提供了重要工具，具有重要意義。

人博卡病毒1型；NS1；NP1；VP1/2；抗體；免疫熒光

人博卡病毒1型(human bocavirus 1,HBoV1)是Allander等[1]于2005年首次在下呼吸道感染患者中發現的，歸屬于細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬。HBoV1粒子直徑為26 nm，基因組約5.5 kb，是一種體積較小、具有二十面體衣殼、無包膜的單鏈線性DNA病毒，末端為反轉重復序列(ITR)或發夾結構，為病毒復制所必須。HBoV1由左端唯一啟動子啟動基因轉錄，其后續蛋白產生及成熟的詳細過程仍有待深入研究[2]。基因組序列、轉錄譜和表達譜分析表明，HBoV1主要表達2種衣殼蛋白(VP1和VP2)及2種非結構蛋白(NS1和NP1)，其中，VP1、VP2長度分別為672 aa、542 aa，具有典型的基因重疊區。VP1的N端為非重疊區，長度為129 aa，即VP1獨特區(VP1-unique，VP1u)；后面為VP1和VP2的重疊區(VP1/2)，長度為542 aa，序列完全相同[3]。

HBoV1是一種全球流行的重要呼吸道病毒，可引起上、下呼吸道感染[4-5]。研究表明，感染HBoV1后會導致分化的組織樣氣道上皮細胞(HAE)的纖毛減少、緊密連接破壞、細胞肥大，這些與肺損傷的組織變化非常相似[2]，在一定程度上解釋了HBoV1的致病機制。同時，HBoV1感染引起的氣道上皮細胞纖毛的減少和緊密連接的破壞可能導致人體對外部病原體的抗感染屏障遭到破壞，從而對其它病原體易感，在一定程度上解釋了HBoV1存在的高共感染率。這表明，HBoV1感染的影響可能不僅僅局限于自身疾病的產生，同時也導致其它病原體易感，其與AAV2/HBoV1形成的嵌合病毒有作為基因治療載體的潛質[6]。

目前，HBoV1純病毒除在三維分化的組織樣呼吸道上皮細胞中能夠正常感染增殖外，無法通過常規的細胞培養獲得，采用反向遺傳技術也只能獲得少量HBoV1純病毒[2]。所以，對HBoV1的研究還處于初級階段，對其病毒包裝、感染性及致病性的研究仍然迫切。

作者前期研究[5]中從一名60歲女性肺炎患者中獲得了HBoV1廣州株GU338055，在此對HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進行原核表達、純化，并通過免疫小鼠獲得其抗體，擬為后續研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 HBoV1廣州株主要抗原NS1、NP1及VP1/2片段PCR擴增

1.1.1 引物設計

對HBoV1廣州株主要抗原NS1(aa 640～781)、NP1(aa 1～219)、VP1/2(aa 369～475)片段進行PCR擴增引物設計，如表1所示。

表1 HBoV1廣州株主要抗原片段PCR擴增引物

1.1.2 擴增反應

以前期獲得HBoV1廣州株時構建的反向遺傳系統全長質粒作為模板，使用Ex Taq 50 μL體系(Takara)分別對NS1、NP1、VP1/2片段進行擴增反應。

擴增反應體系：HBoV1廣州株核酸模板(質粒)0.5 μL,10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1.5 μL,Ex Taq(5 U·μL-1)0.5 μL,ddH2O補足至50 μL。

擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。

1.1.3 擴增產物純化

取2 μL 擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用TIANprep DNA gel extraction kit(天根生化科技(北京)有限公司)進行目標DNA的凝膠回收及純化。

1.2 原核表達載體構建、蛋白表達及純化

1.2.1 原核表達載體構建

利用pGEX-4T-3質粒構建HBoV1主要抗原原核表達載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。

(1)質粒與純化的擴增片段酶切

用SalⅠ和NotⅠ(NEB)分別對pGEX-4T-3質粒及純化的NS1、NP1、VP1/2擴增產物進行雙酶切，于37 ℃水浴2 h，使用TIANprep DNA gel extraction kit進行目標DNA的凝膠回收及純化。

50 μL酶切體系：NE buffer 3.15 μL、酶切目標核酸15 μL、SalⅠ 1 μL、NotⅠ 1 μL、ddH2O補足至50 μL。

(2)連接

使用T4 DNA ligase(NEB)分別連接酶切的pGEX-4T-3與NS1、NP1、VP1/2，構建原核表達載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2，于16 ℃水浴2 h。

10 μL連接體系：T4 DNA ligation buffer 1 μL、pGEX-4T-3 酶切產物4 μL、NS1或NP1或VP1/2酶切產物4 μL、T4 DNA ligase 1 μL。

(3)轉化

使用E.coliTOP10感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司)轉化連接產物。步驟如下：冰上融化感受態細胞，吸取連接產物至感受態細胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，迅速轉至冰浴2 min，加入無抗性LB培養基 500 μL至37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養1 h，取200 μL涂布含氨芐青霉素LB(LB-Amp+)固體平板，于37 ℃培養箱中倒置過夜培養。

(4)驗證

挑取平板上的單菌落至含0.8 mL LB-Amp+液體培養基的1.5 mL離心管中，37 ℃、250 r·min-1培養4～5 h，使用菌落PCR進行陽性克隆篩選，即用表1中各片段擴增引物分別進行驗證。

菌落PCR條件：單菌落培養物0.5 μL、10×Ex Taq buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)1 μL、正向引物(10 μmol·L-1)1 μL、反向引物(10 μmol·L-1)1 μL、Ex Taq(5 U·μL-1)0.2 μL、ddH2O補足至25 μL。

驗證反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段。陽性克隆每種蛋白，挑選2例測序驗證。

使用AxyPrep質粒DNA小量試劑盒(Axygen)分別提取最終確認正確的pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2。使用0.5 μL提取質粒轉化E.coliBL21感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司)，方法同前。

1.2.2 蛋白表達及純化

(1)蛋白表達

用IPTG(Sigma)誘導蛋白表達，通過調整IPTG濃度、誘導時間、誘導溫度使目標蛋白可溶。步驟如下：挑取pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2陽性E.coliBL21分別接種至5 mL LB-Amp+液體培養基中，37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養過夜；分別取4 mL培養物接種至400 mL LB-Amp+液體培養基中，37 ℃搖床中250 r·min-1振蕩培養3～4 h，加入IPTG進行蛋白誘導表達。3種蛋白的誘導條件分別為：pGEX-NS1，IPTG終濃度0.5 mmol·L-1、37 ℃、250 r·min-1誘導4 h；pGEX-NP1，IPTG終濃度0.2 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1誘導16 h；pGEX-VP1/2，IPTG終濃度0.4 mmol·L-1、20 ℃、250 r·min-1誘導16 h。

(2)蛋白純化

破碎細菌：5 000 r·min-1離心15 min，收集菌體，加入20 mL PBS重懸細菌，冰上超聲(開20 s、停5 s、功率70%)10～20 min破碎細菌至菌液變青色。4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min，得上清。

純化樹脂準備：將GST-Bind Resin(Novagen)親和純化樹脂重懸并吸取2 mL至50 mL離心管中，4 ℃、500×g離心5 min，吸棄上清；加入20 mL 預冷的PBS重懸樹脂洗去乙醇，4 ℃、500×g離心5 min，吸棄上清；加入1 mL 預冷的PBS重懸樹脂，備用。

純化：將破碎細菌上清液加至準備好的純化樹脂中，室溫下輕搖30 min；轉移混合物至柱子中，注意樹脂中不要有氣泡；用15 mL 預冷的PBS洗柱子3次；用含還原性谷胱甘肽的洗脫液洗脫目標蛋白；用10 kDa超濾管(Millipore)濃縮目標蛋白；12% SDS-PAGE檢測目標蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。

1.3 小鼠免疫及效價評價

1.3.1 小鼠免疫

取100 μL目標蛋白(50 μg)，用100 μL完全弗氏佐劑(Sigma)充分乳化，腹腔注射BALB/c 六周齡小鼠，總計4次免疫。免疫后取血清。

1.3.2 效價測定

用制備的抗原及臨床HBoV1陽性樣品分別進行ELISA抗體評價。將制備的抗原或臨床HBoV1陽性樣品用包被液稀釋到4 μg·mL-1，酶標板每孔加入100 μL,4 ℃包被24 h；棄孔中液體，用150 μL封閉液于37 ℃封閉2 h；棄孔中液體并洗滌5次，每次3 min；加入不同稀釋度的血清樣品進行檢測，以未免疫小鼠血清作為陰性對照，37 ℃放置30 min；用洗滌液滿孔洗滌5次,每次3 min；加入酶標抗體(HRP-羊抗鼠)，37 ℃放置30 min；洗滌5次后，用TMB-過氧化氫尿素溶液底物反應(Millipore)，37 ℃避光放置3～5 min,加入終止液顯色，測A450值。

1.4 抗體在HBoV1免疫熒光實驗中的應用

用所制備的抗體血清對電轉HBoV1反向遺傳系統全長質粒的AD293細胞進行HBoV1的免疫熒光實驗：用LONZA電轉試劑電轉質粒至AD293細胞，電轉后培養在24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h。用所制備抗體進行其主要抗原NS1、NP1及VP1/2的免疫熒光檢測。步驟如下：24孔板中細胞用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定15～30 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min，PBS浸洗孔3次，每次3 min；吸干PBS，在孔中加入正常10%山羊血清，室溫封閉30 min；吸棄封閉液，每孔加足夠量的稀釋(1∶50)制備一抗血清，以陰性小鼠血清作為陰性對照，濕盒中37 ℃放置1 h；PBST 浸洗孔3～6次，每次3 min；吸干孔中多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗(FITC-羊抗鼠)(聯科生物)，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBST浸洗孔3次，每次3 min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作都盡量在較暗處進行)；吸干孔中液體，用含抗熒光猝滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結果與討論

2.1 HBoV1主要抗原片段原核表達載體構建

通過PCR擴增獲得了主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目標片段(圖1)，利用pGEX-4T-3構建了原核表達載體pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2(圖2)，并最終通過測序驗證正確。

M.DNA marker

2.2 蛋白表達與純化

在不同誘導條件下，獲得了HBoV1 主要抗原NS1、NP1及VP1/2的目標片段可溶性表達，通過GST親和層析，獲得了GST融合蛋白：GST-NS1(41.62 kDa)、GST-NP1(50.09 kDa)、GST-VP1/2(37.77 kDa)，濃度分別為188 μg·mL-1、523 μg·mL-1、373 μg·mL-1，如圖3所示。

M.DNA marker 1,4.pGEX-4T-3 2,3.pGEX-NP1 (其中3被證實為非目標質粒) 5.pGEX-VP1/2 6.pGEX-NS1

M.蛋白marker

2.3 免疫與抗體效價

通過免疫BALB/c小鼠，獲得一批免疫血清，分別使用蛋白抗原和臨床HBoV1陽性樣品對其進行評價，結果見表2、3。

從表2可知，使用NS1、NP1、VP1/2蛋白抗原進行評價時，與陰性小鼠血清對比，3種主要抗原的A450值升高2倍以上的稀釋度分別起始于1∶80 000、1∶40 000和1∶160 000。從表3可知，使用臨床HBoV1陽性樣品進行評價時，與陰性小鼠血清對比，3種主要抗原的A450值在稀釋度為1∶50的情況下都約有4倍提升。

2.4 抗體在HBoV1免疫熒光實驗中的應用

以1∶50稀釋度的制備抗體作為一抗，以陰性小鼠血清作為一抗對照，以FITC-羊抗鼠作為二抗，用所制備的抗體對利用反向遺傳系統制備的HBoV1進行主要抗原的檢測，結果如圖4所示。

表2 蛋白抗原ELISA檢測不同血清稀釋度下的A450值

注：設置3個平行復孔，數據為A450值mean±sd,下表同。

表3 臨床HBoV1陽性樣品ELISA檢測不同血清稀釋度下的A450值

從圖4可以看出，相關抗原分布在細胞中。

2.5 討論

HBoV1是全球流行的重要呼吸道病毒，由于其無法在常規的呼吸道病毒培養細胞中培養分離，難以獲得純病毒，目前只發現在分化的組織樣呼吸道上皮細胞中能夠感染與增殖，未建立相應的動物模型，所以對其感染與致病機制還需更進一步的研究。

圖4 所制備抗體對HBoV1主要抗原的免疫熒光檢測結果(200×) Fig.4 Immunofluorescence detection results of HBoV1 major antigens using prepared antibody(200×)

本研究針對HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2進行抗體制備。利用pGEX-4T-3質粒成功構建了pGEX-NS1、pGEX-NP1、pGEX-VP1/2 GST融合表達載體。為了使目標蛋白處于可溶狀態，保證親和層析的順利進行，針對3種蛋白分別采用了不同的誘導條件，低溫低IPTG誘導條件保證了NP1、VP1/2的可溶性表達，純化效果較好；但NS1的純化效果相對較差，有較多的雜蛋白，雖然進行了改進，但效果不明顯。

本研究通過腹腔免疫小鼠獲得抗體血清，并分別利用目標蛋白抗原和臨床HBoV1陽性樣品評價抗體效價。在利用臨床HBoV1陽性樣品進行評價時，3種血清在1∶50稀釋度時A450值均可獲得約4倍提升，滿足樣品后續的實驗應用。

本研究以所制備的抗體作為一抗進行了針對HBoV1廣州株反向遺傳系統電轉制備的病毒的免疫熒光檢測，獲得了良好的效果。

3 結論

針對HBoV1主要抗原NS1、NP1、VP1/2，通過原核表達的方式進行蛋白表達，并通過純化、免疫小鼠成功獲得了3種蛋白的抗體血清，通過ELISA評價了抗體對相應蛋白抗原及臨床HBoV1陽性樣品的效價。結果表明，制備抗體在1∶50稀釋度時A450值對陰性對照約有4倍提升，并成功用于HBoV1廣州株GU338055反向遺傳系統的NS1、NP1、VP1/2的免疫熒光研究中。為HBoV1后續深入研究提供了重要的工具，具有重要意義。

[1] ALLANDER T,TAMMI M T,ERIKSSON M,et al.Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(36):12891-12896.

[2] HUANG Q,DENG X,YAN Z,et al.Establishment of a reverse genetics system for studying human bocavirus in human airway epithelia[J].PLoS Pathogens,2012,8(8):e1002899.

[3] BABKIN I V,TYUMENTSEV A I,TIKUNOV A Y,et al.A study of the human bocavirus replicative genome structures[J].Virus Research,2014,195:196-202.

[4] ESKOLA V,XU M,SODERLUND-VENERMO M.Severe lower respiratory tract infection caused by human bocavirus 1 in an infant[J].Pediatric Infectious Disease Journal,2017.DOI:10.1097/INF.0000000000001681.

[5] LIU W K,CHEN D H,LIU Q,et al.Detection of human bocavirus from children and adults with acute respiratory tract illness in Guangzhou,southern China[J].BMC Infectious Diseases,2011,11:345.

[6] YAN Z Y,KEISER N W,SONG Y,et al.A novel chimeric adenoassociated virus 2/human bocavirus 1 parvovirus vector efficiently transduces human airway epithelia[J].Molecular Therapy,2013,21(12):2181-2194.

PreparationandApplicationofAntibodiesAgainstMajorAntigensNS1,NP1,andVP1/2ofHumanBocavirus1

LIU Wen-kuan,YOU Ai-ping,XU Duo,QIU Shu-yan,ZHOU Zhi-chao,LI Chi,ZHOU Rong

(StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,GuangzhouMedicalUniversity,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510230,China)

Human bocavirus 1(HBoV1) is an important respiratory virus in the world,and its research is still at an early stage.We expressed the major antigens NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 by prokaryotic expression,obtained successfully the antibody serums of three proteins by purification and immunization of the mouse,and evaluated the titers of antibodies by ELISA for the corresponding protein antigens and clinical HBoV1 positive sample.Meanwhile,the prepared antibodies were successfully applied in the immunofluorescence study of NS1,NP1,and VP1/2 of HBoV1 Guangzhou strain GU338055 reverse genetic system.The results indicated that,theA450values of the antibodies prepared at 1∶50 dilution were about 4 times higher than that of the negative control,which provided an important tool for the further study of HBoV1,and would be of important significance.

human bocavirus 1;NS1;NP1;VP1/2;antibody;immunofluorescence

國家自然科學基金(青年基金)項目(31500143)

2017-08-07

劉文寬(1982-)，男，安徽六安人，博士，助理研究員，研究方向：臨床病毒學，E-mail：ahlwk2000-2004@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.002

劉文寬，游愛萍，許多,等.人博卡病毒1型主要抗原NS1、NP1及VP1/2的抗體制備及應用[J].化學與生物工程，2017，34(12)：4-9.

R373 Q78

A

1672-5425(2017)12-0004-06