基于超高效液相色譜-質譜的膠質瘤患者血漿代謝組學研究

左莉華，丁大領，沈 燕，師瑩瑩，孫 志，李卓倫，周 霖，徐曇燁，劉麗偉，張曉堅

(1.鄭州大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院 神經外科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學第一附屬醫院 檢驗科，河南 鄭州 450052)

研究報告

基于超高效液相色譜-質譜的膠質瘤患者血漿代謝組學研究

左莉華1*，丁大領2，沈 燕3，師瑩瑩1，孫 志1，李卓倫1，周 霖1，徐曇燁1，劉麗偉1，張曉堅1*

(1.鄭州大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學第一附屬醫院 神經外科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學第一附屬醫院 檢驗科，河南 鄭州 450052)

采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術對膠質瘤患者和正常對照人群的血漿進行代謝輪廓分析，篩選膠質瘤代謝標志物，為其發病機制闡明和臨床早期診斷提供科學依據。通過對UHPLC-Q-Orbitrap HRMS采集得到的譜圖進行峰識別、峰匹配和去噪等處理后，應用主成分和正交偏最小二乘-判別分析法對代謝組學數據進行統計分析，篩選VIP>1.0及P<0.05的差異代謝物，并進一步對其診斷能力進行評價。結果顯示，膠質瘤患者的血漿代謝輪廓發生明顯變化，發現并鑒定得到10個差異代謝物，其中亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、膽堿和牛磺酸在膠質瘤患者血漿中含量降低，組氨酸、檸檬酸、乳酸、肌酸和丙酮酸含量升高，與正常對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)，提示氨基酸和能量等代謝異常可能對膠質瘤的發生發展具有重要影響。此外，各差異性代謝物對膠質瘤均顯示出較好的診斷能力(AUC>0.8)，可作為潛在診斷標志物。

膠質瘤；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜技術；代謝組學；診斷標志物

神經膠質瘤(Glioma)簡稱膠質瘤，是一種發生于神經外胚層的原發性顱內惡性腫瘤，約占所有顱內腫瘤的45%，其惡性程度高且發病率逐年遞增[1-2]。盡管近年來膠質瘤在臨床治療和分子診斷方面取得了重大進展[3-5]，但膠質瘤發病機制及患者預后仍不明確，雖然有積極的外科手術以及輔助放療和化療，其復發仍不可避免，尤其是膠質母細胞瘤患者2年的存活率僅為10%[6-7]。因此，臨床早期診斷和及早治療是降低膠質瘤死亡率的關鍵。目前臨床上缺乏膠質瘤的特異性診斷標志物，其診斷主要依靠影像學檢查和病理檢查，而影像學檢查不具有針對性，病理學檢查會因組織標本取材的隨機性、不同資歷醫師的診斷主觀性而導致結果有所偏差[8-10]，這些傳統方法特異性差且易受主觀經驗影響，因此發現早期膠質瘤特異標志物對于臨床診斷至關重要。

代謝組學是通過高通量分析手段如氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術、核磁共振(NMR)技術、毛細管電泳質譜聯用(CE-MS)技術等研究機體受擾動后內源性代謝物變化的一門學科[11]。近年來，隨著高分辨質譜的快速發展，超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)由于具有質量分辨率高、靈敏度高的特點在代謝組學研究中越來越受到人們的關注[12-14]，Liu等[14]基于UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS技術對健康女性飲用蔓越莓汁前后的血漿進行代謝組學研究，為蔓越莓有益于人體健康的物質基礎提供了理論驗證。本研究首次采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術探究膠質瘤血漿代謝指紋譜，結合多元統計分析方法進行非靶向代謝組學研究，尋找膠質瘤疾病早期診斷的生物標記物，并利用受試者工作曲線(ROC)評價生物標志物的診斷識別能力，為其發病機制闡明和臨床早期診斷提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive 超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀器(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Vortex-Genie型渦旋振蕩器(美國 Scientific Industries公司)；BX7200HP臺式超聲波清洗器(上海新苗醫療器械制造有限公司)；Heraeus Fresco 17 Centrifuge離心機、Forma 88000 Series超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)。

乙腈、甲酸(均為色譜純，美國Thermo Fisher公司)，實驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.2 樣品收集及制備

以磁共振成像檢查結果及術后病理診斷為依據，收集2016年12月至2017年5月在鄭州大學第一附屬醫院收入住院的膠質瘤患者28例(男18例，女10例，平均年齡54歲)，所有膠質瘤患者均無其他代謝性疾病。收集健康志愿者26例(男15例，女11例，平均年齡53歲)。

所有血樣采集于患者清晨空腹狀態下，每個研究對象采集靜脈血3 mL置于EDTA抗凝采血管中，采集后于4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，吸取上清(血漿)，立即于-80 ℃冰箱內保存備用。

樣品處理：血漿樣品檢測前于冰上解凍，取100 μL血漿樣品，加入300 μL 4 ℃預冷的乙腈，渦旋5 min混勻，于4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min，取上清隨機進樣分析。

質控(Quality control，QC)樣本的制備：從所有血漿樣品中各吸取10 μL，渦旋5 min混勻后，按照上述“樣品處理”方法進行QC樣品前處理。為保證數據的可靠性，QC樣本穿插在所有樣本數據采集過程中，每9個樣本插入1個QC樣本。

1.3 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

1.3.1色譜條件Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A 為乙腈，B 為0.1% 甲酸水。梯度洗脫程序：0～1.0 min，5% A；1.0～5.0 min，5%～40% A；5.0～7.0 min，40%～50% A；7.0～9.0 min，50%～80% A；9.0～15.0 min，80% A；15.0～18.0 min，80%～100% A；18.0～22.0 min，100% A；22.0～25.0 min，5% A；流速0.2 mL/min，進樣量5 μL；柱溫40 ℃。

1.3.2質譜條件采用可加熱的電噴霧離子源(HESI)，離子源溫度350 ℃，輔助氣溫度300 ℃，輔助氣流速10 μL/min，離子傳輸管溫度320 ℃；正離子模式：鞘氣流速40 μL/min，噴霧電壓3.50 kV；負離子模式：鞘氣流速38 μL/min，噴霧電壓2.80 kV。質譜分析掃描模式：Full scan/dd-MS2，掃描范圍m/z80.00～1 200.00，二級質譜分辨率為17 500，質荷比窗口寬度為2，碰撞能梯度為20、30、40 eV。

1.4 數據處理

血漿樣品用 UHPLC-(±) ESI MS 進行檢測，得到樣品的總離子流色譜圖，將檢測得到的原始數據導入SIEVE 1.3軟件對各組血漿樣品圖譜進行色譜峰對齊、基線校正以及峰面積歸一化預處理。經過預處理的數據導入SIMCA 14.0軟件進行多元統計分析，建立主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析模型，通過得分圖比較兩組差異。所有數據運用SPSS 21.0進行兩獨立樣本t檢驗，將重要變量性投影(Variable importance in projection，VIP)值大于1.0及P<0.05的變量作為潛在的差異標志物，將潛在差異化合物的二級譜圖與Metlin、HMDB、KEGG等網絡數據庫進行比對鑒定。

表1 研究人群的人口統計學和臨床病理特征Table 1 Demographic and clinical pathological characteristics of study population

2 結果與討論

2.1 受試者臨床病理特征

所有膠質瘤患者均進行影像學及病理學檢查確診，受試者的臨床病理特征見表1。

2.2 血漿代謝輪廓分析

采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分別在正負離子模式下對血漿樣本進行檢測，圖1為隨機選取的膠質瘤患者和健康人的血漿代謝指紋圖譜，兩組間代謝輪廓在正負離子模式下均有明顯的差異，表明膠質瘤患者體內存在一定的代謝紊亂。

2.3 血漿模式識別分析

采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對血漿進行代謝組學分析時，為考察方法穩定性，每分析9個血漿樣本穿插1個QC樣本進行檢測，通過QC樣本的穩定性來監測結果的可靠性。QC樣本在正負離子模式下的PCA模型顯示所有QC樣本均在2倍SD范圍內，說明分析方法穩定性好。

對膠質瘤組與對照組兩組血漿進行模式識別，正負離子模式下兩組間的PCA模型顯示，沿PC1軸即第一主成分兩組可明顯區分(圖2A和圖2D)，表明膠質瘤患者血漿代謝物相比于健康人有顯著差異；OPLS-DA模型去除與樣本分類無關因素，顯示兩組樣本點完全分離，組內樣本點趨于集中(圖2B和圖2E)，表明膠質瘤患者體內代謝網絡發生明顯變化；在正離子模式下，OPLS-DA模型相關參數R2Y和Q2分別為0.992和0.997，負離子模式下R2Y和Q2分別為0.995和0.987，均大于0.5，說明模式識別建立成功，具有很好的擬合及預測能力(圖2C和圖2F)。

2.4 潛在標志物鑒定

根據精確分子量、二級質譜碎片信息和保留時間與數據庫或標準品的比較進行潛在標記物的鑒定。以負離子模式下的離子m/z191.019 70 為例，說明生物標記物的鑒定過程。負離子模式下，該離子的提取離子色譜圖及在保留時間1.61 min 時的質譜圖如圖3A 和圖3B 所示。將精確分子量與數據庫中化合物進行比對，初步鑒定該化合物為檸檬酸。如圖3C，與標準品的二級質譜結果比對，兩者完全一致。根據以上信息，此生物標記物被鑒定為檸檬酸。其它化合物的鑒定同上所述，但一些化合物未能完全定性，表2列出了潛在生物標記物的鑒定結果。圖4為鑒定的潛在標志物在兩組間的變化趨勢熱圖，紅色表示代謝物表達量升高，綠色表示代謝物表達量降低，直觀顯示出兩組間代謝物的變化趨勢。

圖1 膠質瘤患者與健康者的血漿代謝指紋譜Fig.1 Representative metabolic fingerprinting spectra of plasma from glioma patient and healthy controlESI+ mode:A.healthy control,B.glioma patient; ESI-mode:C.healthy control,D.glioma patient

圖2 正負離子模式下膠質瘤患者與健康者血漿LC-MS譜的多元統計分析Fig.2 Multivariate statistical analysis of LC-MS plasma spectra between gliomas and healthy controls in positive mode and negative modeESI+ mode:A.PCA plot,B.OPLS-DA prediction model,C.permutation analysis;ESI- mode:D.PCA plot,E.OPLS-DA prediction model,F.permutation analysis

圖3 負離子模式下檸檬酸的提取離子色譜圖(A)、一級質譜圖(B)與二級質譜圖(C) Fig.3 Extraction ion chromatogram(A),full MS spectrum(B) and MS/MS spectrum(C) of citric acid in negative ion mode

表 2 膠質瘤患者的血漿差異代謝物Table 2 Differential metabolites identified between glioma patients and healthy controls

2.5 血漿標志物的診斷能力

對篩選鑒定出的10個差異性標志物作受試者工作曲線(Receiver operator characteristic,ROC)，用于評價各差異代謝物對膠質瘤的診斷識別能力(圖5)，曲線下面積(AUC)在大于0.5時方具有診斷價值，越接近1表明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7之間診斷準確性較低，在0.7～0.9之間具有較好的準確性，在0.9以上具有極高的準確性。鑒定出的10個代謝物的ROC曲線下面積均大于0.8，表明各差異性代謝物對膠質瘤具有很好的辨別能力，研究發現膽堿與檸檬酸對膠質瘤患者具有很高的識別能力(AUC=1)，顯示膠質瘤患者體內存在顯著的膽堿與檸檬酸的代謝異常。

圖4 差異性代謝物熱圖分析Fig.4 The heat map of verified differential metabolites

圖5 10個差異代謝物的受試者工作曲線Fig.5 The receiver operating curves of 10 differential metabolites

2.6 膠質瘤潛在標志物的生物學意義

相比于健康受試者，膠質瘤患者體內氨基酸代謝存在明顯紊亂，其中色氨酸、亮氨酸和纈氨酸與膠質瘤的發生呈負相關，組氨酸與膠質瘤的發生呈正相關。亮氨酸和纈氨酸的含量顯著下降，這兩者為體內支鏈氨基酸(Branched-chain amino acid，BCAA)，與神經遞質的合成、蛋白降解關系密切。T?njes 等[15]研究發現，神經功能障礙與BCAAs分解代謝的下調密切相關。也有研究發現隨著膠質瘤惡性程度增高，分解BCAAs的支鏈氨基酸氨基轉移酶1的表達也逐漸增高[16]。針對BCAA的分解代謝以及支鏈氨基酸氨基轉移酶1的表達，將有望為診治膠質瘤找到關鍵代謝通路以及治療靶點。

近年來，人們越來越關注色氨酸在腦膠質瘤中的異常代謝現象。色氨酸作為人體必需氨基酸之一，其在維持機體免疫細胞活性及增殖中具有重要作用。本研究結果顯示，膠質瘤患者體內色氨酸含量顯著降低，膠質瘤細胞通過2,3-雙加氧酶(TDO)促進色氨酸的大量降解，一方面色氨酸缺乏會誘導免疫細胞發生凋亡；另一方面色氨酸代謝產生犬尿氨酸，有研究[17]發現犬尿氨酸會與腫瘤微環境中的免疫細胞芳香烴受體(AHR)結合誘導T細胞凋亡并抑制其他免疫細胞功能。Bessede等[18]發現TDO能將色氨酸轉化成AHR的一個內生配體，從而直接作用于神經膠質瘤細胞上導致腫瘤的發生。

在能量代謝方面，乳酸、檸檬酸、丙酮酸、肌酸在膠質瘤患者體內表達量顯著升高，這些物質為神經細胞提供能量。大量研究認為，大多數腫瘤細胞都會發生Warburg效應[19-20]，即在線粒體氧化供能不足時，將進行有氧糖酵解，會產生大量乳酸改變腫瘤微環境，然而腫瘤細胞糖酵解的機制目前仍不清楚，還需后續大量研究進行探索。

膠質瘤患者體內膽堿含量的降低會引起體內脂質代謝紊亂，由甘油二酯和活化的膽堿合成的磷脂酰膽堿是細胞膜磷脂的主要成分之一，因此膽堿含量的變化能夠反映出細胞的受損程度以及免疫能力，并能夠調控細胞凋亡，該物質含量發生變化可表明膠質瘤患者體內發生代謝異常。本研究中也發現牛磺酸在膠質瘤患者血漿中表達量降低，牛磺酸是人體的一種必需氨基酸，亞牛磺酸作為牛磺酸的氧化產物，能夠促進膠質瘤的發生發展，有研究發現其與膠質瘤惡性程度呈正相關[21]，亞牛磺酸及牛磺酸代謝通路將是未來膠質瘤發病機制研究的重要方向。

3 結 論

本研究首次采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術進行膠質瘤血漿代謝組學研究，尋找到潛在的膠質瘤早期診斷標志物，為膠質瘤早期篩查提供了科學依據，也為臨床上膠質瘤的發病機制研究及治療靶點探索提供了新方向。

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Study on Plasma Metabolomics of Glioma Patients by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ZUO Li-hua1*,DING Da-ling2,SHEN Yan3,SHI Ying-ying1,SUN Zhi1,LI Zhuo-lun1,ZHOU Lin1,XU Tan-ye1,LIU Li-wei1,ZHANG Xiao-jian1*

(1.Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China; 2.Department of Neurosurgery,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China; 3.Department of Clinical Laboratory,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)

In this study,the ultra high performance liquid chromatography-Q exactive hybrid quadrupole-orbitrap high-resolution accurate mass spectrometry(UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS) was firstly applied in the analysis of the plasma from the glioma patients and the normal control group to find the differential metabolites,which could provide the scientific evidence for clinical diagnosis and pathogenesis research.The spectra obtained by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS were conducted to peak identification,peak matching and denoising.The data of metabolomics were statistically analyzed by using principal component analysis and orthogonal partial least-squares-discriminant analysis method to screen the differential metabolites with VIP>1.0 andP<0.05,which were investigated to further evaluate the diagnostic ability.The results showed that the plasma metabolic profiles of glioma patients were dramatically altered,and ten potential biomarkers were identified.The metabolites of leucine,valine,tryptophan,choline and taurine were significantly reduced in glioma patients,while histidine,citric acid,lactic acid,creatine and pyruvic acid were obviously increased compared with the normal controls(P<0.05),which suggested that amino acid and energy metabolism might play an important role in the development of glioma.In addition,the different metabolites showed good diagnostic ability toward gliomas(AUC>0.8),which could be used as potential diagnostic biomarkers.

glioma; ultra high performance liquid chromatography-Q exactive hybrid quadrupole-orbitrap high-resolution accurate mass spectrometry; metabolomics; diagnosis biomarker

2017-08-24；

2017-09-12

北京醫衛健康公益基金會醫學科學研究基金(YWJKJJHKYII-B17819)

*

張曉堅，主任藥師，研究方向：醫院藥學，Tel:0371-66913047，E-mail:zhangxiaojian_yxb@163.com

左莉華，博士，主管藥師，研究方向：代謝組學與質譜分析，Tel:0371-66862570，E-mail:zuolihua2013@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.001

O657.7；O657.63

A

1004-4957(2017)12-1417-07