蘇黃止咳膠囊對咳嗽變異性哮喘豚鼠的干預作用研究

高明 張忠德 李際強 李洪濤

摘要 目的：觀察蘇黃止咳膠囊對咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）豚鼠模型的影響。方法：將55只豚鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組及蘇黃止咳膠囊高、低劑量組，結合文獻方法制作CVA豚鼠模型，檢測各組豚鼠咳嗽次數、支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中嗜酸粒細胞百分率及氣道阻力變化。結果：與正常對照組比較，模型對照組豚鼠咳嗽次數、BALF中嗜酸性粒細胞百分率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型對照組比較，蘇黃止咳膠囊高、低劑量組豚鼠咳嗽次數明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），蘇黃止咳膠囊高劑量組豚鼠的氣道阻力在乙酰甲膽堿濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL時下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05），蘇黃止咳膠囊高劑量組豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞百分率下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：蘇黃止咳膠囊對CVA豚鼠的咳嗽次數、BALF中嗜酸性粒細胞百分率及氣道阻力有改善作用。

關鍵詞 咳嗽變異性哮喘；蘇黃止咳膠囊；豚鼠；氣道阻力

Abstract Objective：To observe the effects of Suhuang Zhike capsule on guinea pig model of cough variant asthma. Methods：Fifty-five female guinea pigs were randomly divided into normal control group， model control group， prednisone acetate tablets group and Suhuang Zhike capsule high and low dose group. Based on related literature， set up the guinea pig model of cough variant asthma. Then observe the changes of the cough frequency， the percentage of eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and resistance （detection of resistance used the BUXCO RC system）. Results：Compared with the normal control group， the cough frequency and the percentage of eosinophils in BALF of the model control group was significantly increased （P<0.05）； Compared with the model control group， the cough frequency in guinea pig of Suhuang Zhike capsules high and low doses group was reduced obviously （P<0.05）， and the resistance in guinea pigs of Suhuang Zhike capsules high dose group was decreased （P<0.05） when methacholine concentration is 0.2 mg/mL， 0.4 mg/mL， the percentage of eosinophils in BALF of Suhuang Zhike capsules high dose group was decreased obviously （P<0.05）. Conclusion：Suhuang Zhike capsules could ameliorate cough frequency， percentage by eosinophils in BALF and resistance in CVA guinea pig.

Key Words Cough variant asthma； Suhuang Zhike capsules； Guinea pig； Resistance

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.036

CVA在臨床上是一種常見的特殊類型的哮喘。名老中醫晁恩祥教授所研制的蘇黃止咳膠囊臨床應用于CVA患者，對患者咳嗽、咽癢、氣急等癥狀有顯著療效[1]。本實驗從咳嗽敏感性、肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的百分率及氣道阻力的變化，探討蘇黃止咳膠囊治療CVA豚鼠模型可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 55只雌性普通級豚鼠，體質量（300±50）g，由南方醫科大學實驗動物中心提供（合格證號：44002100005781）。

1.1.2 藥物 雞清白蛋白（OVA）溶液（購自GBCBIO Technologies公司）：將1 g雞清白蛋白干粉溶于25 mL的生理鹽水中先配置成4%OVA溶液，并用生理鹽水稀釋2%OVA溶液。氫氧化鋁干粉（購自天津惠瑞化工科技有限公司，生產編號：20141111）。辣椒素溶液：取辣椒素（購自SIGMA公司）30.5 mg，依次加入吐溫-80 ℃溶液及無水乙醇各1 mL溶解，再加入生理鹽水8.0 mL，配成10-2 μmol/L的辣椒素原液，取1 mL的辣椒素原液，稀釋至100 mL，成10-4μmol/L溶液。乙酰甲膽堿溶液（乙酰甲膽堿購自SIGMA公司），0.8 mg乙酰甲膽堿溶于1 mL的生理鹽水中，對倍稀釋成0.4 mg/mL和0.2 mg/mL的溶液。

1.1.3 試劑 蘇黃止咳膠囊由揚子江藥業集團有限公司生產，批號為15051811，成人用量3粒/次、1次/d、0.45 g/粒。

1.2 方法

1.2.1 熏煙箱與用法 熏煙箱為定制的長、寬、高分別為100 cm×60 cm×60 cm的不銹鋼箱體。本實驗所用香煙為“紅梅”過濾嘴香煙（紅塔煙草有限責任公司；烤煙型香煙-焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.7 mg，煙氣一氧化碳量12 mg）。每次在熏煙箱中點燃10根香煙，將香煙點燃后，通過300 mL注射器和三通管的人工操作將煙霧排入熏煙箱，直至香煙燃完。

1.2.2 模型制備與分組 實驗動物隨機分為正常對照組、模型對照組、蘇黃止咳膠囊高、低劑量組、醋酸潑尼松組。除正常對照外的動物在第1～28 d，熏煙0.5 h/d；第15天每只豚鼠注射2% OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁的混懸液，第22天每只豚鼠注射2% OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁的混懸液加強致敏1次，第29天用1% OVA霧化攻擊，連續7次，1次/d[2-4]。正常對照組給予同樣劑量的生理鹽水。所有動物飼養在普通環境，12 h/12 h光照循環，自由飲水和食用顆粒飼料。

1.2.3 給藥方法 在第29天霧化攻擊當天開始給藥，蘇黃止咳膠囊配置成高劑量組為6 g/kg，低劑量為2 g/kg，醋酸潑尼松組為3 mg/kg。灌胃給予相應的藥物，1次/d，連續7 d。正常對照組和模型對照組給予同樣劑量的生理鹽水。

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 咳嗽敏感性的測定（CRS） 通過辣椒素咳嗽激發試驗判斷氣道的咳嗽敏感性。采用全身體積描記法（Buxco Electronics WBP System）：1%OVA最后一次霧化攻擊后的第2天，將豚鼠放入體描箱內，用10-4 μmol/L辣椒素溶液霧化2 min后觀察并記錄豚鼠5 min的咳嗽次數。

1.2.4.2 氣道高反應性測定 CRS測定24 h以后，有創方法通過RC系統（Buxco Electronics RC System），觀察豚鼠氣道阻力（RI）的變化。測定基值后，測定30 μL生理鹽水及倍增濃度的乙酰甲膽堿（MeCh）激發霧化后RI的變化，MeCh的激發濃度由低到高，依次為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL每次霧化1.5 min，觀察5 min，并自動記錄下每個濃度級別下的氣道阻力值（RI）。

1.2.4.3 支氣管肺泡灌洗液的收集和支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數分類 待激發試驗完成后，支氣管肺泡灌洗3次，2 mL/次PBS，并回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）。將收集的BALF取200 μL并以3 000 r/min離心10 min，轉移上清液，加入紅細胞裂解液后，3 000 r/min離心10 min，轉移上清液，加入等量PBS涂片，蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下進行嗜酸性粒細胞計數，在顯微鏡下計連續視野中每200個細胞中嗜酸性粒細胞的數量，并計算出嗜酸性細胞的百分率。將收集的BALF取100 μL，以3 000 r/min離心10 min，轉移上清液，加入紅細胞裂解液后，再以3 000 r/min離心10 min，加入等量PBS，取10 μL進行細胞計數。其余BALF離心后取上清，-80 ℃保存備用。

1.3 統計學方法 上述數據采用SPSS 17.0統計分析軟件進行計算，數據以（±s）表示，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組豚鼠CRS測定[5-7] 與正常對照組比較，模型對照組咳嗽次數明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；治療組的咳嗽次數明顯低于模型組，蘇黃止咳膠囊高、低劑量組的咳嗽次數與模型對照組比較顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；3個治療組之間比較，說明蘇黃止咳膠囊能抑制動物的咳嗽反應，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組豚鼠的氣道高反應測定結果 各組動物在生理鹽水激發前的基值和生理鹽水激發后的氣道阻力（RI，cmH2O*secs/mL）值，差異無統計學意義（P>0.05），但蘇黃止咳膠囊高劑量組與模型對照組比較在生理鹽水激發時差異有統計學意義（P<0.05）。乙酰甲膽堿激發后，氣道阻力值變化比較明顯，造模的組較正常組氣道阻力上升明顯，在乙酰甲膽堿濃度為0.2 mg/mL時，正常組和蘇黃止咳膠囊高、低劑量組與模型對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），蘇黃止咳膠囊低劑量組和激素組與高劑量組比較差異有統計學意義（P<0.05）；在乙酰甲膽堿濃度為0.4 mg/mL時，正常組和蘇黃止咳膠囊高劑量組與模型對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）；在乙酰甲膽堿濃度為0.8 mg/mL時模型組的阻力值較前一個激發濃度有所下降，蘇黃止咳膠囊低劑量組和激素組與蘇黃止咳膠囊高劑量組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖1。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中白細胞計數及嗜酸性粒細胞百分率的測定結果 與正常組比較，模型對照組的嗜酸性粒細胞百分率及細胞總數明顯上升（P<0.05）；與模型對照組比較，治療組的嗜酸性粒細胞百分率及細胞總數有所下降，高劑量組明顯減少（P<0.05）；激素組的嗜酸性粒細胞的百分率稍有上升；3個治療組之間比較，蘇黃止咳膠囊高劑量組的嗜酸性粒細胞百分率較激素組顯著下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05），細胞總數較激素組和低劑量組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

CVA主要臨床表現為陣發性、刺激性的干咳，且夜間為重，無明顯胸悶氣喘等癥狀，具有氣道的高反應性。在感冒、遇冷熱刺激、灰塵、異味、等多種因素作用下可誘發咳嗽，臨床中使用抗生素治療的效果不佳。中醫對此早有記載，將該病歸為“咳嗽”“風咳”等病證范疇，《醫門法律》曰：“風、火、熱、濕、燥及寒，皆能乘肺，皆足致咳”。《諸病源候論》記載：“有十種咳、一曰風咳，欲語因咳言不得是也”，因此“風咳”居于首位，雖屬哮喘，但以咳為主，即名曰“風咳”。晁恩祥教授提出風邪獨立致咳的觀點，以“風咳”立論[8]，研制了蘇黃止咳膠囊，其方以麻黃為君，宣肺止咳平喘；紫菀、五味子等為臣，斂肺止咳化痰，疏緩氣道；佐以蘇子、前胡等，配合麻黃宣降相協；配蟬蛻等使藥加強疏散風邪，并能利咽止癢。

本實驗采用有創的方法觀察乙酰甲膽堿激發試驗檢測豚鼠的氣道阻力（RI）[7]。RC系統是Buxco檢測動物氣道阻力與動態肺順應性的系列有創系統中的新產品，檢測時需要對動物進行麻醉，并實施氣管切開手術，通過測量端口壓、跨肺壓或胸膜壓以及氣道中氣體流速等參數，得出氣道阻力等肺功能指標參數。與Hao-yan Jiao等[9]采用無創方法所測定Penh（增強呼吸間歇）不完全相同。實驗結果顯示，模型對照組的RI隨著乙酰甲膽堿的濃度升高而逐漸升高，但是在乙酰甲膽堿的濃度為0.8 mg/mL時的氣道阻力較較濃度為0.4 mg/mL時的氣道阻力有所降低，考慮其一個可能原因是在濃度為0.8 mg/mL時相對于前幾個濃度樣本數量減少，豚鼠個體差異性大，最后獲得數據的樣本個體氣道阻力值偏低；另一個可能原因和熏煙有關，一方面增加了咳嗽反應的敏感性，同時也增加了動物對乙酰甲膽堿激發反應的敏感性，可能導致乙酰甲膽堿濃度在0.4 mg/mL達到了最大能承受的激發濃度值，具體原因還需進一步實驗證實。經過蘇黃止咳膠囊和激素治療，各組豚鼠的氣道阻力在乙酰甲膽堿濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL時下降明顯，且在3個濃度的乙酰甲膽堿（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL）激發下，蘇黃止咳膠囊高、低劑量組的氣道阻力值低于激素組，說明蘇黃止咳膠囊在降低氣道阻力值、減緩氣道高反應的效果優于激素治療。CVA的高反應性和氣道阻力介于哮喘患者和正常人之間，暴露了氣道的刺激感受器，對外界的各種理化因素刺激的敏感程度明顯提高，故可以引起頑固性持續性咳嗽[10]。咳嗽是CVA唯一或是主要的臨床表現，本實驗采用辣椒素誘發咳嗽產生，測定豚鼠的咳嗽次數，其原理是通過霧化吸入特異性的刺激物，激活氣道感覺神經末梢的咳嗽感受器，誘發咳嗽的產生，以激發物的濃度和咳嗽成都判斷CRS[11]。造模組的豚鼠的咳嗽次數較正常對照組明顯增多，說明模型是成功的，而經過中藥和激素治療，咳嗽次數減少，并且蘇黃止咳膠囊高、低劑量組咳嗽次數較激素組少，說明蘇黃止咳膠囊可以有效緩解豚鼠的咳嗽癥狀。氣道慢性炎性反應是CVA的重要發病機制[12]，是以嗜酸性粒細胞浸潤為主的氣道炎性反應[13]。模型對照組的豚鼠BALF中嗜酸性粒細胞的百分比和細胞總數明顯升高，經過蘇黃止咳膠囊治療的高、低劑量組嗜酸性粒細胞的百分率明顯下降，說明了蘇黃止咳膠囊可以減輕嗜酸性粒細胞的浸潤狀況，使嗜酸性粒細胞的百分率降低。

綜上所述，實驗中蘇黃止咳膠囊可以改善CVA豚鼠模型的咳嗽癥狀，改善豚鼠模型的氣道阻力以及減輕嗜酸性粒細胞的浸潤。其作用機制可能通過減輕嗜酸性粒細胞的浸潤，從而減輕炎性反應，同時降低氣道阻力，減輕高反應性，以達到治療目的。

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