中藥散劑在抗腫瘤轉移實驗中的研究

魏華民 花寶金

摘要 目的：中藥散劑在動物實驗中應用較少，本研究重在對比中藥散劑和煎劑在腫瘤學常規體內外實驗中的差異。方法：根據文獻及藥物特性制備雙參顆粒散劑、煎劑及醇提產物，體外實驗對比醇提雙參顆粒散劑和傳統水煎劑對Lewis肺癌細胞的影響；動物實驗觀察2種劑型對C57BL/6荷瘤小鼠肺轉移的抑制作用。結果：和傳統煎劑相比，雙參顆粒醇提產物對腫瘤細胞有更明顯的抑制增殖及遷移、促進凋亡的作用，其優勢在于抑制早期腫瘤生長的作用，對肺轉移無顯著優勢。結論：中藥散劑和傳統湯劑在腫瘤學常規實驗中有較大差別，應進一步深入研究。

關鍵詞 中藥散劑；水煎劑；腫瘤

中圖分類號：R283.6；285.2 文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.039

中藥散劑是傳統的中藥劑型之一，在臨床治療中有其特定的優勢與不可替代性。但目前中藥相關動物實驗中多為中藥煎煮灌胃，以散劑進行的嚙齒類動物實驗研究較少。而文獻提示：有些藥物的有效成分不溶于水或難溶于水，散劑作為彌補這一缺陷的重要方式缺乏相應的實驗研究。本試驗以雙參顆粒為例，對比了散劑與傳統水煎劑對腫瘤細胞的作用差異及對荷瘤小鼠肺轉移的影響，發現散劑醇提產物與傳統湯劑相比對腫瘤細胞的增殖有更明顯的抑制作用，還可促進腫瘤細胞凋亡并抑制其遷移能力，并抑制早期腫瘤生長，這不僅為散劑在臨床中的應用提供實驗數據支持，而且為探索中藥散劑在嚙齒類動物實驗研究中的進一步應用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 Lewis腫瘤細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺，用高糖DMEM培養液（hyclone）加10%胎牛血清（Gibco）培養，取對數生長期細胞進行細胞實驗。

1.1.2 動物 SPF級C57 BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，19-21 g，飼養于中國中醫科學院廣安門醫院動物房，符合中國中醫科學院廣安門醫院動物實驗倫理委員會標準。

1.1.3 藥物 1）雙參顆粒散劑飼料制備：西洋參、冬蟲夏草、三七（1：1：6）3種中藥飲片均由中國中醫科學院廣安門醫院中藥房提供（產品批號412041）。3種藥物均經紫外線聯合75%乙醇滅菌，衛生質量符合2000版《中華人民共和國藥典》標準。干燥溫度控制在30℃，干燥后用無菌粉碎機進行粉碎并過100目篩備用。按照小鼠進食量4g/d（前期摸索結果）計算，將藥粉和小鼠飼料混合（散劑飼料濃度為4.5%）進行實驗，平均每只小鼠進食藥物為180mg/d。2）雙參顆粒醇提產物制備：根據文獻，三七醇提2次，乙醇濃度85%，加醇倍量6 mL/g，提取時間7.5h；西洋參醇提2次，乙醇濃度為70%，加醇倍量8 mL/g，提取時間4 h；冬蟲夏草醇提2次，乙醇濃度為75%，加醇倍量為8 mL/g，提取時間為24h，提取溫度為23-25℃。各組提取產物均離心（2200 r/min）得到醇提產物，三者混合并調至合適細胞生長的滲透壓及pH值即為雙參顆粒醇提物。3）傳統水煎劑即用去離子水煎煮3種按比例配置的藥材飲片，煎煮時間為1h，煎煮2次，將水煎劑濃縮至相應體積，藥物濃度為180mg/200uL。

1.1.4 試劑 Cell Counting Kit-8試劑盒（DOJIN-DO，CK04-500）；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒（ Abcam，ab14085）；Bouin's Fluid（江萊生物，DF0010）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠在動物房適應性喂養7d后，于實驗前按體重對小鼠進行分組，保證2組體重比較差異無統計學意義，且散劑組采用單籠飼養，以精確計算小鼠食量。取1X106對數生長期細胞接種于C57BL/6小鼠背部皮下構建小鼠肺癌模型。

1.2.2 給藥方法 傳統水煎劑組（n=20），每只小鼠每天灌胃200 uL雙參顆粒水煎劑；散劑組（n=20），由動物自由進食，每天稱飼料重量，計算小鼠實際進食藥量。

1.3 檢測指標與方法 觀察24h、48h、72h細胞增殖、凋亡和遷移情況，實驗結束時，將處死小鼠肺部病灶制成病理切片，置于顯微鏡下拍照觀察。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.o軟件進行統計分析，2組之間計數資料比較采用兩樣本間t檢驗，采用log-rank檢驗比較2組生存時間，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般情況 2組動物觀察共35d，觀察期間2組體重、動物活動能力、皮毛光澤及平均進食量未見明顯差異。未觀察到動物不良反應，未出現動物異常損失情況。

2.2 體外細胞實驗

2.2.1 細胞增殖實驗 采用相同藥物濃度（25uguL）的醇提產物及傳統水煎劑進行細胞增殖實驗，結果如下：2組藥物在24h對腫瘤細胞的生長未見明顯差異，在48h及72h時，醇提組和水煎劑對腫瘤細胞生長的抑制率分別從（0.25±0.02），（0.56±0.03）上升至（0.27±0.02）和（0.89±0.02），差異有統計學意義（P<0.001）。

注：A上3圖分別為24h、48h、72h醇提散劑組細胞增殖情況；A下3圖分別為24h、48h、72h傳統湯劑組細胞增殖情況。

2.2.2 細胞凋亡實驗 我們進一步研究了2組不同制劑對腫瘤細胞凋亡的影響，其中在24h即表現出明顯的差異，如圖2所示，24h中藥干預和正常組比較，水煎劑組對腫瘤細胞的凋亡略顯促進，但差異無統計學意義；而醇提組腫瘤細胞表現出較明顯的早期凋亡，2組比較差異有統計學意義（P=0.002）。

注：上圖左、右及下圖左側分別為正常組、傳統煎劑組和醇提散劑組；下圖右側為2組藥物對細胞凋亡率比較。

2.2.3 細胞遷移實驗 腫瘤細胞的遷移能力是腫瘤發生轉移的重要條件，所以評估腫瘤細胞遷移是腫瘤常規實驗中的重要環節。我們分析了24、48、72 h3個時間點，觀察2種制劑對腫瘤細胞遷移的影響，圖3為72h時正常組、水煎劑組及醇提組的圖片。Imagepro plus軟件分析提示：三者的遷移距離分別為：（300.67±21.31），（150.33±15.11）及（584.67±85.85），差異有統計學意義（P=0.001）。

注：A上3圖分別為Oh正常組、傳統煎劑組和醇提散劑組的細胞劃痕圖片；A下3圖分別為3組72h時劃痕實驗圖片。

2.3 動物實驗

2.3.1 抑瘤效果及對小鼠生存期的影響 觀察至接瘤后35d，2組小鼠實際進食藥物量分別為散劑162 mg/d和水煎劑180 mg/d（P=0.000）。2組抑制腫瘤早期生長差異顯著（圖4），其中第14天差異最大（P=0.010），之后隨著腫瘤的不斷長大，2組之間差異逐漸消失。生存期方面，2組比較差異無統計學意義（P=0.635）。

注：左圖片2組腫瘤體積比較（長x寬2），右圖為生存時間（綠色部分為傳統水煎劑，褐色部分為散劑）。

2.3.2 對肺轉移的影響 接種GFP、Lewis腫瘤細胞第35天時取小鼠肺切片，熒光顯微鏡觀察2組肺轉移的熒光值及相對面積，散劑組平均熒光值為（15.35±0.53），熒光面積比例（%Area）為（54.51±2.15）。水煎劑組為（15.48±0.37）和（57.51±0.73）。無論是熒光值還是熒光面積比較，2組差異無統計學意義（P=0.8071和P=0.2023）。見圖5。

注：A圖為散劑組，B圖為水煎劑組，C圖為2組熒光值及面積比較。

3 討論

雙參顆粒是中國中醫科學院廣安門醫院花寶金教授研制的用于肺癌術后抗復發轉移的中藥散劑，在臨床取得較好的效果并申請國家專利。我們以該藥為例，從動物和細胞實驗證實，中藥散劑具有傳統湯劑不可替代的作用。

中藥散劑屬于中藥傳統劑型之一，古書中有“散者散也，去疾病用之”的說法。中藥成分復雜，有些藥物的有效成分不溶于水或難溶于水，必須直接吞服藥粉，通過消化道分解吸收。有些藥物不能高溫煎熬，有效成分容易破壞；有些貴重藥物只有通過吞服才能確保療效又不造成浪費。散劑的藥物面積大，與溶媒的接觸面大，具有易分散、奏效快的特點，有效成分易溶出，與湯劑相比，更省藥材而療效不減。散劑在臨床應用中具有一定的不可替代性，實驗研究證實五苓散散劑比湯劑在利水消腫方面療效顯著，基礎實驗證實：五苓散湯劑中低極性化學成分較散劑中嚴重缺失，可能是其臨床療效差異的主要原因。

雖然目前臨床應用散劑相對廣泛，但基礎實驗應用散劑較多的集中于獸醫學，臨床醫學基礎實驗涉及的中藥散劑較少，不能反映散劑在治療疾病中的真正價值。我們通過實驗證實，雙參顆粒散劑雖然在延長荷瘤小鼠生存期及肺轉移方面未顯示出優于傳統煎劑的價值，但病理切片提示，散劑明顯抑制微觀轉移灶的形成，且細胞實驗提示其具有傳統湯劑不具備的對腫瘤細胞的抑制作用，這可能與高溫對皂苷成分有一定的破壞作用有關，也可能與不同條件下藥物析出成分差異有關。這提示我們，對于不同的疾病，應采用不同的劑型，以保證藥物發揮最佳的效應。當然本研究只是采用了散劑的傳統制備方法來說明問題，最近散劑劑型已經有了新的發展，如超微粉體技術就是較傳統散劑更有效的現代綜合技術，不僅使藥材破壁率大大提高，還能加快固體藥物的溶解、釋放，提高生物利用度，提高臨床療效。此外，中藥粒子設計技術及中藥超微速溶飲片也為散劑的研究提供了新的研究思

路。這些新技術均應在臨床基礎實驗中得到廣泛研究，避免只用傳統湯劑進行動物實驗而不能充分顯示中醫中藥的治療效果。

本實驗只初步評估了散劑較傳統湯劑的優勢作用，但仍存在一下缺點：1）雙參顆粒臨床中用于肺癌術后患者，可能是本試驗在延長生存期及肺癌轉移方面未得出陽性結果的主要原因，針對肺癌術后小鼠的實驗可能更能顯示出散劑的優勢。2）本實驗提示，中藥治療腫瘤的優勢在于腫瘤負荷較輕時，針對無腫瘤負荷給藥即腫瘤轉移前微環境給藥可能得到更好的效果。3）本實驗未能進行中藥質譜分析，對中藥進行精確的含量控制可為以后藥物提純及新藥開發提供更可靠的基礎。

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（2017-01- 11收稿 責任編輯：王明）