納米材料體外細胞毒性研究現狀與展望

汪保林 邱慧

摘要 納米科學是上個世紀80年代末發展起來的新興學科，是21世紀最有前途的新科學技術之一。隨著納米材料應用的日益廣泛，其所帶來的健康風險也越來越大，對其生物安全性的研究也刻不容緩。文章就納米材料的毒性影響因素，對細胞造成的毒性效應機制及其體外細胞毒性的評價方法進行詳細闡述，并綜述了近幾年來關于納米材料毒性研究的最新進展及對納米技術安全性評估進行了系統的討論。

關鍵詞 納米材料；細胞毒性；影響因素；評價方法

Abstract Nanoscience emerged in the last 1980 s and is developed as one of the most promising new science and technology in the 21st century. With the increasing widespread application of nanomaterials，their health risk has been greatly increased and researches on its biological safety are imperatively needed. In this paper，the toxic influential factors，the cytotoxicity mechanism of nanomaterials and the evaluation methods on cytotoxicity of nanomaterials in vitro were elucidated in detail. Simultaneously，the latest developments on the toxicity of nanomaterials and the security assessment of nano technologies were also systematically discussed.

Key Words Nanomaterials；Cytotoxicity；Influential factors；Evaluative methods

中圖分類號：R-331；R319文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.052

從“納米牙膏”到“納米防曬霜”，全球目前已有300多種運用納米技術上市的產品。納米技術開始走進人們的生活圈，它們在環境和人群中的暴露率大大增加。目前對納米材料可能的、潛在的安全性問題報道甚少。因此，對納米顆粒生態安全性的評估也刻不容緩。雖然納米材料的應用在一般情況下都不會造成嚴重的直接暴露，但納米材料一旦進入機體就會在體內蓄積，最終導致嚴重的生物毒性。大量研究表明：正常無害的大分子物質一旦做成納米級可能會具有潛在毒性。與此同時，工程化納米材料在醫學診斷和治療上的有效利用，造成機體對納米顆粒的細胞攝取，循環系統和神經系統的轉運與分布的特殊動力學行為，也成為了納米材料致生物毒性的主要原因[1]。綜上所述，只有全面了解納米材料的毒性行為，才能更好地應用納米材料并發展納米技術。

1 納米材料的毒性影響因素

納米材料的毒性取決于多種因素，除了與材料的純度，尺寸大小，化學結構，團聚狀態，劑量大小及所帶電荷相關外，還與曝露時間，曝露途徑以及納米材料的表面修飾、表面活性密切相關[2]。不同納米材料的毒性效應存在差異，一般情況下，納米顆粒粒徑越小，其潛在毒性越大[3]。而這種差異與顆粒本身的其他特殊性質如表面特征，聚合狀態以及化學組成等有密切關系[4]。

在體外毒性實驗中，納米顆粒會被分散于細胞培養基中，此時，顆粒處于水溶液環境，包括粒徑等其他特征會發生相應變化，而這些變化很可能會影響到顆粒與生物體的作用方式及強度大小。動物實驗發現：經體外灌注產生的納米毒性效應與顆粒的粒徑和表面積息息相關，即隨著納米顆粒減小，其表面積會增大，隨后會產生更強的炎性反應[1]。與此同時，劑量大小也是影響納米顆粒細胞毒性的重要關鍵因素。在0～15 ppm的研究范圍內，納米SiO2對鼠胚胎成纖維細胞和人體皮瘤細胞無明顯毒性作用，但當納米SiO2顆粒劑量高于138 μg/mL時，會導致細胞膜的嚴重損傷[5]。多數納米金屬及其金屬氧化物顆粒在水溶液中易發生團聚效應，團聚后的顆粒其粒徑大小決定了顆粒是通過細胞內吞作用，ROS誘導的吞噬作用還是其他機制進入細胞內部[6]。暴露途徑決定了生物屏障和納米材料間的作用關系。就目前的研究來看，肺部是納米顆粒主要的攝入器官，呼吸途徑毒性是明確的，納米材料可引起機體呼吸系統的炎性反應，但口服、皮膚接觸，正常機體非疾病狀態時，納米材料其實無法突破生物屏障。據報道，細胞膜表面帶負電荷，因此細胞易與表面帶正電荷的顆粒、離子以及小分子物質發生相互作用，從而進入細胞內部[7]，在細胞內蓄積并產生嚴重的生物毒性。Richards，D等研究表明，無機材料包覆的納米顆粒的表面電荷及表面疏水性是細胞毒性的可控因素，表面帶正電荷的納米材料相對其他帶負電荷或中性的納米材料而言具有更強的毒性效應，且納米顆粒的細胞毒性效應也會隨著表面疏水性的增強而增強[8]。目前，對于多數納米材料的毒性評價都只停留在簡單的表面毒性方面，對于其毒性機制的研究尚不深入，急需廣泛關注。

2 納米顆粒細胞毒性發生機制

研究細胞毒性效應產生主要包括以下3個方面：線粒體活性的抑制，細胞膜完整性、通透性的改變，其次是氧化應激誘導細胞凋亡或壞死。具有不同理化性質的納米材料可通過不同的毒性機制產生不同的炎性反應及毒性反應。Lai等將納米顆粒與細胞相互作用后誘導產生細胞毒性及其他反應機制歸納為如下幾點[9]：1）與細胞膜發生相互作用，引起離子轉運及信號轉導的不穩定性甚至導致細胞死亡；2）與線粒體發生相互作用，改變新城代謝途徑或者干預抗氧化防護體系和ROS的產生；3）與DNA發生作用，破壞DNA片段結構，抑制細胞周期的分裂和蛋白質的合成；4）與細胞骨架發生相互作用，阻礙囊泡的運轉，產生機械性損傷并導致細胞死亡；5）與磷脂、蛋白質或者其他生物大分子作用，造成不同程度的細胞損傷。

線粒體是對各種細胞損傷最為敏感的細胞器之一，在細胞損傷時最常見的病理改變主要包括線粒體大小，數量以及結構的改變，凋亡或受損的線粒體最終可由細胞的自噬過程加以處理并被溶酶體降解消化。Chou cc[21]等指出，小鼠經灌注SWCNT后，肺組織病理切片中發現肺巨噬細胞可經內吞作用攝入SWCNT，并隨著時間和劑量的增加肺巨噬細胞內沉積的SWCNT顆粒越多，甚至能產生肉芽腫病變。上述研究充分證明了碳納米管確實可以與細胞膜表面發生相互作用，并在細胞內沉積，繼而產生細胞毒性。但是，目前關于CNT進入細胞的途徑研究尚處于探索階段，需要進一步深入證實。

納米顆粒誘導氧化應激的機制主要是當金屬型納米顆粒分散在適當試劑當中會催化ROS的生成，發生Fenton反應，從H2O2氧化得到OOH-和OH-等氧化離子。此外，一些惰性納米材料雖然不具備自發生成ROS的能力，但是當納米離子能夠靶向聚集在線粒體時，在一些生物條件下能夠誘導ROS的生成。低水平的氧化應激會促使機體保護性反應的發生，而高水平的氧化應激則會導致機體的過氧化損傷[10]。細胞組織在受到自由基的氧化脅迫時，構成細胞組織的各種物質如糖類、蛋白質、脂質以及DNA等大分子物質會發生各種氧化反應，導致交聯、變性、斷裂等氧化損傷以及細胞結構和功能的破壞，產生機體組織和器官的病變，最終導致毒性反應。

Nel等[10]也提出ROS的生成和機體的氧化應激反應是納米材料誘導多種生物毒性效應的重要機制。納米SWCNTs，SiO2，ZnO對小鼠胚胎成纖維的毒性研究結果表明，納米ZnO的細胞毒性高于其他非金屬納米顆粒，可引起細胞內ROS水平的顯著上升，谷胱甘肽的大量耗竭，丙二醛以及超氧化物歧化酶含量的明顯降低，在此證明氧化應激可能是納米材料細胞毒性的一個主要途徑[4]。An等[11]發現，碳納米管可結合于DNA上，導致DNA的損傷，造成機體遺傳毒性。綜上可知，納米材料會造成細胞內結構損傷，存活率下降，細胞內氧化自由基水平升高以及DNA斷鏈等毒性反應，致使細胞在一定條件下發生凋亡。

3 體外細胞毒性實驗研究現狀

體外毒性檢測主要包括2個方面：納米顆粒在無細胞體系中的活性和納米顆粒與細胞的相互作用。納米顆粒在細胞體系中的活性包括蛋白質的反應，補體激活以及氧化自由基的產生等。檢測納米材料與細胞的作用首先是要區別是什么細胞毒性，而一般藥物的毒性作用不是誘導細胞凋亡就是細胞壞死。

3.1 氧化應激檢測方法

納米顆粒致細胞毒性的一個重要途徑就是誘導發生氧化應激。氧化應激反應主要的檢測方法有：通過DCFH-DA[12]熒光標記法，黃嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法，羅丹明123熒光染色，硫代巴比妥酸法等檢測細胞內ROS含量；Amplex Red熒光染色可檢測細胞內脂質氫過氧化物；C11-BODIPY熒光染色，GSH試驗方法[13]等檢測細胞內脂質過氧化；免疫印跡法檢測SOD的表達，氯化硝基四氮唑蘭（NBT）可檢測細胞內SOD的活性，DTNB可檢測機體抗氧化系統的損傷。

3.2 細胞凋亡檢測方法

細胞凋亡是指機體在一定的生理或病理條件下，遵循一定程序自身結束生命的過程。細胞核濃縮、染色體凝聚、DNA片段化、細胞縮小、分解，凋亡小體的形成等是細胞凋亡的主要形態變化特征，但對周圍細胞無明顯影響。可用于檢測細胞凋亡的試驗主要包括如下幾種方法：

形態學觀察：普通光學顯微鏡（Ordinary Optical Microscopy），熒光顯微鏡（Fluorescence Microscope）和透射電子顯微鏡（Transmission Electron microscopy，TEM）可對染毒細胞的形態進行分析。凋亡細胞形態依據為：細胞染色質濃集，靠近核膜，產生核邊集現象；染色質斷裂、核膜裂解，凋亡小體形成等典型的細胞凋亡形態。

DNA損傷所引起的細胞毒性效應檢測方法主要有彗星試驗，TUNEL法，流式細胞儀法[14]等檢測手段，流式細胞術檢測凋亡的常用方法包括：1）DNA熒光檢測；2）抗熒光抗體染色熒光檢測；3）末端標記法檢測；4）線粒體膜電位檢測。彗星試驗是將少量分散的細胞與低熔點瓊脂糖液混合后鋪在預冷的瓊脂板上制成的，經細胞裂解和堿性解旋，并在堿性環境下進行電泳；當DNA存在斷裂損傷時，細胞核會形成一個類似彗星的圖像，根據彗星的頭部和尾部的含量比率，進而確定細胞DNA損傷的程度。TUNEL法的原理是：當細胞凋亡時，染色體DNA會斷裂并產生大量的3-OH粘性端，在相關轉移酶的作用下，將脫氧核糖核苷酸與過氧化物酶或堿性磷酸酶的反應形成的衍生物標記到DNA的3-OH端，并通過熒光定量分析或酶聯顯色技術分析細胞凋亡情況。AMES試驗及微核檢測法可用于納米材料誘導的基因遺傳毒性檢測[15]。FITC-Annexin V/PI雙熒光標記法[16]，DNA階梯法（DNA ladder）[17]，Caspase[18]發光實驗也可用于檢測細胞凋亡。

3.3 細胞壞死檢測方法

細胞壞死是在病理條件下產生的被動死亡（凋亡是主動死亡），如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。壞死細胞的膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期核無明顯形態學變化，最后細胞破裂，細胞內含物釋放到細胞外，導致炎性反應。細胞膜完整性是一個可以用來評價細胞活力的指標，因此細胞壞死檢測可包括LDH法[19]，熒光物質檢查法，臺盼蘭法（Trypan Blue）[20]，中性紅（Neutral Red Assay）[21]以及碘化丙啶（PI）[22]染色法等。乳酸脫氫酶（LDH）是細胞內穩定的蛋白酶，主要存在于正常細胞的細胞質中，當細胞受損傷或凋亡時會釋放到細胞外；LDH能催化乳酸形成丙酮酸鹽，丙酮酸鹽和四氮唑鹽反映形成紫色的結晶物質甲瓚，可在490～500 nm出測量吸光度值，從而判斷細胞壞死程度，此法操作簡便、快捷，是常用的納米材料細胞毒性評價的方法。目前，熒光物質已成為流式細胞儀或微孔板細胞檢測中的理想物質，這些熒光物質可以是細胞膜通透的或者是細胞膜非通透的，他們或者直接結合與核酸，或者要求主動的細胞代謝來產生可檢測的熒光，從而檢測細胞活性。這類方法檢測速度快，通量大、成本低，越來越受到科研工作者的青睞。染料排斥法是測定細胞存活率常用方法，其原理是存活得細胞可排斥多種染料而不著色，嚴重受損細胞因細胞膜通透性發生改變，染料可以通過細胞膜而被著色，臺盼藍（Trypan Blue）以及碘化丙啶（PI）是該法常用的染料。中性紅（Neutral Red）是弱的陽離子染色劑，能通過細胞擴散，積累在細胞溶酶體里，如果細胞膜發生改變，中性紅的攝入量就會減少及漏出，可通過測量中性紅攝入的光子譜來區分死細胞和活細胞，判別細胞毒性。Wilhelmi等采用LDH法來檢測納米顆粒對RAW264.7巨噬細胞產生的細胞毒性[23]，方法簡便，結果可靠。

免疫印記法與CDDE（Cell Death Detection ELISA）法，吖啶橙/溴乙非啶（Acridine Orange/ethidium Bromide）[24]試驗及FITC-Annexin V/PI[25]雙熒光標記也可用于細胞毒性檢測，上述方法可用于區別細胞凋亡與細胞壞死。Radziun等[16]采用Annexin V-FITC/PI雙熒光標記，流式細胞術（Flow cytometry，FCM）檢測細胞凋亡，流式細胞散點示意圖左下角為正常細胞百分含量，右下角為早期凋亡細胞百分含量，右上角為晚期凋亡細胞百分含量，以及左上角為壞死細胞百分含量。

3.4 細胞生長抑制檢測方法

細胞生長抑制實驗的方法包括MTT，XTT，WST-1/WST-8，MTS，TTC，Alamar Blue，[3H]胸腺嘧啶摻入法，Brude摻入法及細胞計數法等多種細胞增殖毒性研究方法。MTT，XTT，WST-1/WST-8，MTS，TTC等屬于四氮唑鹽類物質，可以被線粒體內的琥珀酸脫氫酶還原成有色甲瓚，然后通過酶標儀記錄吸光度OD值，繼而檢測細胞毒性的大小。MTT比色法是目前納米材料細胞毒性分析最常用、最經典的方法，MTT在溶液中呈淺黃色，可以被線粒體內的琥珀酸脫氫酶還原生成難溶性的深紫色結晶甲瓚（formazan），并沉淀在細胞中（死細胞無此功能），在特定溶劑中完全溶解，通過酶標儀在570 nm波長附近測定光吸收值。由于甲瓚形成量與細胞數成正比，從而可間接反映活細胞數量。CCK-8是一種MTT的衍生化合物，可以被線粒體內的一系列的氧化脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚晶體。細胞增殖速率越快，甲瓚產生的越多，顏色也會越深；因此細胞毒性越大顏色就越淺。對于同種細胞，溶液顏色的深淺與細胞數目呈正比。WST-8、MTS以及XTT產生的甲瓚晶體都是水溶性的，無需用加DMSO進一步溶解，操作更加簡便。其次，WST-8產生甲瓚的比XTT和MTS產生的更加穩定，測出的結果重現性更好。另外，MTT、XTT等相比WST-8其線性范圍更寬，靈敏度也更高。因此，CCK-8是檢測細胞活性最有利的手段之一。AlamarBlue比色法：細胞快速增殖過程中，細胞內環境會由氧化環境轉化為還原環境，其呼吸鏈中的NADPH/NADP，FADH/FAD和NADH/NAD等的比值也會升高；AlamarBlue被細胞攝取后，在細胞質中會被以上代謝中間體還原，而釋放到細胞外；被還原AlamarBlue的累積會使培養基由靛青藍轉變成粉紅色，并通過酶標儀或分光光度儀來檢測培養基中OD值和熒光強度的變化，繼而分析細胞增殖的情況。相對MTT、WST、CCK等四唑鹽類物質，AlamarBlue毒性最小，價格便宜，且染色后細胞還可以繼續培養。

細胞毒性試驗的檢測手段多種多樣，但是一味的選擇最快、最貴的方法是不明智、不合理的。一些有關碳納米管的毒性研究結果分歧也相當大。Worle-Knirsch[22]等指出，用MTT比色法進行細胞活性測定得出碳納米管對A549細胞有明顯的細胞毒效應，而實際上，碳納米管可能會與MTT復合物反應，繼而形成復雜的結合物，導致其不能被DMSO溶解，使測定吸光度下降，最終造成細胞活性下降的假陰性結果。然而，使用WST-1方法對細胞存活力進行測定時，發現碳納米管并無細胞毒性。Richards[8]等采用MTT、中性紅、IL-8及透射顯微鏡等四種方法對碳納米管進行細胞毒性檢測。有趣的是，四種方法顯示出了不同結果。研究者將上述發現歸結于以下兩點：首先經觀察發現納米材料能吸收MTT染料和中性紅染料而產生假陰性與假陽性結果；其次，碳納米材料具有吸收培養基中存在的營養物質的潛能，這些都將降低細胞生長數并且誤導實驗結果。因此建議采用2種或2種以上的方法，包括CCK-8，MST，INT，XTT，WST-1，TTC等方法來同時測定納米材料的細胞毒性或者至少采用一種不會產生不良反應可能性的研究手段來確證細胞毒性效應。例如用顯微鏡來評估細胞病理形態學，以便能夠對實驗結果的可靠性進行相互佐證，防止出現類似錯誤的假象。

3.5 納米材料細胞毒性的最新檢測方法

納米微粒毒性研究的一大難題就是納米粒的毒性可能隨著其理化性質（形狀，大小，凝結效應，表面修飾，化學結構，結晶作用）的改變而使納米材料變得復雜化，多樣差異化而難以評定。傳統的毒性測試使用的動物模型往往是不切實際的，因為它的時間密集，低容量，價格昂貴，并且只能檢測有限的效應終點。鑒于上述問題，North等[26]提出了中心機制型高通量檢測技術（Mechanism-centered High-throughput Testing）。該方法可很好的解決納米材料因種類差異與數量龐大所引起的迫切問題依賴可預測性的新型毒性檢測系統，高通量篩選技術（High-throughput Screening，HTS）也許會成為評估納米材料生物毒性的最有效的方法。然而就目前研究而言，這種方法單獨用于評估大批量納米材料的毒性實驗是不大可能成功的，需要有效的體內研究相互確證[9]。一些研究者還指出[27]，HTS將不會替代傳統毒性檢測方法，但是其對納米材料毒性深入研究的優化作用有一定的幫助。Sayes[28]等基于對納米材料的特殊理化參數（尺寸大小，表面電荷等）與生物特性（如LDH的釋放）的測量，開發出一種數學模型以反應工程化納米材料的特性是如何影響細胞的反應。該研究表明，計算模型的建立對暴露于納米材料所引起的生物效應的評估能夠很好地運用于預測納米材料毒性檢測。Sadik等人[29]研究出了一種便攜、可溶解氧的電化學傳感器陣列，該方法能夠檢測出工程納米材料（量子點和富勒烯），且具有快速提供納米毒性信息的能力。

4 討論

盡管目前對一些納米材料的生物效應已經有了一些評定，但是各種類型納米顆粒的潛在毒性和可能的機制影響還不是十分清楚。納米材料因其特殊的尺寸、形狀、組分和表面修飾的不同，生物多樣性也明顯超過常規化學物品。考慮到納米材料的高產量和對潛在危害物篩選的急迫性，當前，科學界的首要任務就是在今后一兩年內，達成納米科技對人體及環境影響的國際公約，并建立科學、完善的檢測方法。但現在關于納米材料的毒理學研究較少，無論是體內代謝，細胞作用還是生化反應，都沒有系統的理論。因此，初步建立評價納米材料毒性與其特殊理化性質和體內物質的構效關系模型，是為全面、準確地評價納米材料的毒性提供科學依據，為如何減弱或消除其毒性提供參考。流式細胞術是一種高通量、多參數細胞分子生物學檢測技術，在毒理學研究領域已得到了廣泛的應用。已有研究表明，將高通量篩選技術與基于細胞毒性機制的實驗方法相結合，與相關的納米材料毒性數據進行比較分析，可有效地建立多樣化的理化參數與細胞毒性的關系模型[9]。近年來，一些研究者們也開始轉變傳統的研究思路，逐漸從生物系統的整體性分析入手，探索藥物生物毒性的診斷理論和方法學的新途徑。代謝組學作為一種全新的組學技術，始于上個世紀90年代中期，它利用高靈敏度、高分離效率的儀器，考察了生物體受遺傳和外界環境刺激或干擾后其所有代謝產物的質和量的動態變化，來揭示藥物對生物體的毒性實質和機制。Zomer等人也開始從代謝組學角度對多種常見的毒性物質（如：鎘、D-半乳糖胺、四氯化碳、對乙酰氨基酚等）進行了系統的毒性效應評價[30]。Hadrup等人也運用代謝組學的方法來挖掘納米銀對小鼠造成的毒性作用的靶向器官、靶向位點以及作用的生物標志物和作用機制[31]。

體內、體外毒性研究面臨的最大問題還是評價方法的不確定性和隨意性，目前沒有能直接反應納米材料毒性的客觀指標存在。從生物學體內的角度來看，最容易做，最容易把握的哺乳動物就是小鼠，但是真的上升到模式動物時，在納米毒性靶向不確定的情況下，這種假想是不存在的。例如，果蠅是模式動物，但在遺傳方面運用較多，胚胎干細胞是理想的篩選胚胎毒性的方法，但也只局限在胚胎毒性，在毒性方面只有經過大批量的篩選才能確定納米毒性的整體水平，單單做了幾種細胞，是不能說明納米毒性有多小，什么劑量下才能很好的控制納米毒性。雖然動物試驗能持續提供有關納米毒性的最新信息，但卻有一定的局限性，還需考慮經濟與倫理方面的問題。目前，已有相關技術手段用于模擬與預測納米顆粒在活體內的表現，因此希望在將來能夠開發可以替代活體試驗的檢測手段。

對于這些挑戰，安生·曼雷德教授也表示，納米技術充滿了原始的創新性，是具有戰略性、前瞻性的新興科技，它同時也是一把“雙刃劍”。雖然工程化納米材料可能會產生一些毒性效應，但就目前的研究結果和數據并不能充分的指出這些毒性效應將會成為主導生命健康的大問題。納米材料具有潛在的臨床價值，我們應該積極客觀的看待納米材料帶給我們的影響。例如，一些納米材料能夠靶向作用于線粒體并且啟動程序性的細胞死亡，這一特性能夠成為一種新型的癌癥化療方法。不過要想納米材料很好的應用于我們的生活，造福于人類，納米材料的安全性評估是刻不容緩的。

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