高效液相色譜—紫外—氫化物發生—原子熒光聯用法檢測稻谷中汞含量

[摘要]高效液相色譜一紫外一氫化物發生一原子熒光聯用法（HPLC-UV-HG-AFS）檢測稻谷中汞含量及其化學形態。并對HPLC-UV-HG-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法的線性范圍、準確度和精密度進行了比較。結果表明，在低濃度時，兩種方法的線性和準確度沒有顯著差異，檢測限低，準確度高。但在高濃度時，由于ICP的記憶效應、樣品的基體效應，使得HPLC-ICP-MS法測定的結果準確度降低。HPLC-UV-HG-AFS的線性范圍更寬，成本低，更適合稻谷中汞的測定。

[關鍵詞]稻谷；汞形態；高效液相色譜-紫外-氫化物發生-原子熒光聯用；HPLC-ICP-MS

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180115

在自然界中汞主要以無機汞和有機汞的形態存在，存在形態不同，其毒性和可利用性也有差異。在大氣、水和土壤環境中都存在不同形態的汞，對人類的健康存在一定的威脅，特別是隨著冶金和電解化學的發展，以及農藥、醫藥領域中含汞防腐劑、殺菌劑、滅藻劑、除草劑的使用，使得糧食作物中汞的含量急劇上升。由于稻谷等糧食作物的生物富集作用，使得稻谷中汞含量高于其周圍的土壤環境。因此強化糧食作物特別是稻谷、小麥等主食中汞含量及其化學形態的分析就顯得尤為重要。當前測定糧食作物中的甲基汞已經成為汞污染研究的重點之一，其測定結果不僅對食品中的汞污染控制有重要意義，還能提供水和土壤環境污染狀況的相關信息。

早期的研究主要是利用人工提取和分離的方式，利用氣相色譜、毛細管電泳等方法對有機汞（甲基汞）進行檢測分析。而近年來利用色譜的分離能力與原子光譜的高選擇性、高靈敏度聯用來進行測定不同形態的元素成為分析化學發展的一大熱點，如氣相色譜-冷原子熒光聯用法、液相色譜-原子熒光聯用法。

本試驗建立了提取液消解HPLC-UV-HG-AFS測定稻谷中汞及其形態的方法，并對HPLC-UV-HG-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法在汞測定中的準確度和精密度進行了比較分析，以期為糧食中汞檢測提供更經濟高效的檢測方法。

1材料與方法

1.1試劑和材料

稻谷汞陽性樣品：汞礦區的水稻樣品；大米：市售；氯化鉀、硝酸銅、濃硝酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀、乙酸銨、乙腈、Na₂S₂O₃·5H₂O、二氯甲烷（以上試劑均為分析純）：上海申氏化工；L一半胱氨酸（生化試劑）：上海申氏化工；湖南大米：地球物理地球化學堪測研究所；汞標準儲備液（1000μg/mL）：中國計量科學研究院；氯化甲基汞（純度大于96%）：德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；氨水（優級純）：上海申氏化工；汞標準物質（甲基汞GBW08675），含量為（76.6±2.9）μg/g：中國計量科學研究院。

1.2儀器和設備

FS930型原子熒光光度計：北京吉天儀器有限公司；SA-20型形態分析儀：北京普析通用儀器有限責任公司；1200型高效液相色譜儀及7500a型電感耦合等離子體質譜儀：美國Agilent公司；SIGMA 3K15離心機：德國Sigma公司；IND205天平：瑞士Mettler公司；Milli-Q型純水機（出水電阻率18.2MΩ·cm）：法國密理博公司；PRP-X100型陰離子分離柱：瑞士Hamihon公司；ZORBAXXDB-C18型色譜柱（2.1mm×50mm×5μm）：美國Agflent公司。

所有玻璃器皿用HN03浸泡24h，再用去離子水清洗3遍，超聲清洗器清洗，晾干后備用。

1.3溶液的配制

1.3.1甲基汞標準溶液（100μg/mL）

準確稱取氯化甲基汞13.02mg于100mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解并定容至刻度。然后避光保存于4℃冰箱中。

1.3.2汞標準溶液（100 Ixg/mL）

準確移取1000 μg/mL汞標準溶液10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。避光保存于4℃冰箱中。

1.3.3混合標準溶液的配制（低濃度）

準確移取100μg/mL甲基汞、無機汞標準溶液各1.00mL于100mL容量瓶中，制成1μg/mL的混合標準溶液。分別量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL甲基汞、氯化汞100ng，mL混合標準工作液于50mL容量瓶中，用超純水定容到刻度，配制成濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ng/mL的汞標準工作液現用現配。

1.3.4混合標準溶液的配制（高濃度）

按1.3.3的方法分別配制濃度為25.00、50.00、100.00、200.00、500.00 ng/mL的汞標準工作液。

1.3.5 Na₂S₂O₃溶液（0.01mol/L）

準確稱取0.248g Na₂S₂O₃·5H₂O于燒杯中，加入少量水溶解后轉移并定容至100mL容量瓶中。

1.3.6 KOH溶液（25g/100mL）

準確稱取25g KOH于燒杯中，加入100mL水溶解后轉移至聚四氟乙烯瓶中。

1.3.7提取液

在濃硝酸中加入1mL 1mol/t的硝酸銅和1mL18g/100g氯化鉀作為提取液。

1.4樣品的前處理

1.4.1制粉

準確稱取一定量的稻谷，開糙除殼，制成精米，然后磨粉，過80目篩。

1.4.2微波消解

微波消解工作條件見表1。

1.4.3高效液相色譜-紫外-氫化物發生-原子熒光光譜

準確稱取0.500g大米樣品、標準品及按1.4.1處理后的稻谷陽性樣品，于各個微波消解罐中，加入提取液溶液5.00mL，輕輕振搖，放入微波消解儀中，按表1中微波條件表提取40min。提取結束后，將樣品轉移至離心管中。再加入10mL二氯甲烷，水平振蕩器振蕩30min，5000r/min離心10min。定量移取5.00mL下層二氯甲烷相于塑料離心管中，加入溶液0.01mol/L Na₂S₂O₃溶液2.00mL，振蕩1h，5000r/min離心10min。取1.00mL上層清液于10mL刻度玻璃管中，用水定容并上機測定。

1.4.4高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法

稱準確稱取0.500g大米樣品、標準品及按1.4.1處理后的稻谷陽性樣品，于各個微波消解罐中，加入4mL 25%四甲基氫氧化銨，輕輕振搖，放入微波消解儀中，按表1中微波條件表提取40min。待消解完成，冷卻至室溫后，打開消解罐，將樣品轉移至聚四氟乙烯（PTFE）燒杯中，放置于電熱板上（120～160℃）趕酸至剩余1mL左右，用超純水洗滌3～4次，轉移合并于25mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻待測。汞易揮發，消化液用水多次洗滌后直接合并于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻備用。取2mL上清液于15mL離心管中，逐滴加入1.5mL 35%氨水和0.2mL 2%半胱氨酸，用純水定容至5mL，4℃，8000r/min離心15min，取上清液過0.45μm濾膜，濾液經HPLC-ICP-MS進行形態分析。

1.4.5加標回收率試驗

（1）無機汞加標回收率試驗。準確稱取0.500g制備的樣品（汞陰性稻谷粉末樣品）于微波消解罐中，準確加入1.00mL氯化汞標準溶淮，以下步驟同

1.4.3和1.4.4。

（2）甲基汞加標回收率試驗。準確稱取0.500g制備的樣品（汞陰性稻谷粉末樣品）于微波消解罐中，加入1.00mL甲基汞標準溶淮，以下步驟同1.4.3和1.4.4。

1.4.6儀器條件

（1）HPLC-UV-HG-AFS法液相色譜工作條件：色譜柱為ZORBAX XDB-C18（2.1mm×50mm×5μm）；流動相為60mmol/L L-半胱氨酸-10mmol/L乙酸銨-乙腈（5：5：90）；流速1.0mL/min；進樣體積20μL。

（2）HPLC-UV-HG-AFS法原子熒光光譜儀相關參數配置。氫化物發生參數：還原劑為2%KBH₄+0.35%KOH（1：1）；氧化劑為1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃（1：1：1）；載流為5%HNO₃；間隔氣為空氣。AFS參數：元素燈為Hg（100mA/45mA）；負電壓300V；燈電流60mA；載氣為氬氣，流速300mL/min；屏蔽氣同樣為氬氣，流速600mL/min。測定形態：Hg（Ⅱ）、MeHg、EtHg、PhHg。

（3）ICP-MS法液相色譜工作條件：色譜柱為ZORBAX XDB-C18（2.1mm×50mm×5μm）；流動相為60mmol/L L-半胱氨酸-10mmol/L乙酸銨-甲醇（5：5：90）；流速0.4mL/min；進樣體積20μL。

（4）ICP-MS法質譜儀相關參數配置：RF功率1500W，反射功率<5W，霧室溫度-5℃，等離子氣（Ar）流量15L/min，輔助氣體（Ar）流量0.8L/min，載氣（Ar）流量0.7L/min，氬氧混合氣（Ar/O₂）流量0.2L/min，采樣深度9mm，檢測離子Hg（m/z=2O₂），信號采集模式為時間分辯模式，積分時間0.1s。

2結果與討論

2.1

25%KOH水溶液-微波輔助萃取和濃硝酸/硝酸銅/氯化鉀-微波輔助萃取法的比較

在濃硝酸中加入1mol/L的硝酸銅和18g/100g氯化鉀作為消解萃取液，與單獨的濃硝酸相比，在無機汞測定中，二者沒有顯著區別，而在甲基汞的測定中，濃硝酸，硝酸銅/氯化鉀表現出更高效的提取效率，最高可達89%。可能是銅離子的存在，加速了汞-巰基鍵的斷裂，而氯離子的存在，促進了鹵代烷基汞的（特別是MeHgCl）形成，兩者的協同作用，使得有機汞的提取效率更高。故本實驗中HPLC-UV-HG-AFS法選用濃硝酸，硝酸銅/氯化鉀對樣品中的汞化合物進行提取。回收率試驗見表2。

HPLC-UV-HG-AFS測定汞化合物多采用氫氧化鉀或氫氧化鈉調節酸度，但采用HPLC-ICP-MS測定時，引入的鉀/鈉鹽會抑制ICP，使其穩定性下降，導致數據波動，影響準確性，故本實驗采用堿微波提取法，用35%氨水調節酸度。另外ZORBAXXDB-C18柱適用pH范圍較寬（pH1.5～8.5），故提取液酸度不必嚴格控制。

2.2高效液相色譜條件的選擇

根據原子熒光和ICP-MS的不同特性，對其色譜條件進行了優化。對HG-AFS和ICP-MS而言，提取分離的效率至關重要，由于提取方法的不同（前者采用提取液酸法，后者采用堿提取法），提取液的最終酸度會在一個較寬范圍內分布，所以本實驗采用適用范圍較大（pH1.5～8.5）的ZORBAX XDB-C18色譜柱。由于流動相乙腈的分離效果好于甲醇，故在HG-AFS中，選用乙腈作為流動相。但由于乙腈含碳量較高，易堵塞ICP-MS的錐孔，故ICP-MS采用含碳量低的甲醇作為流動相。由于L-半胱氨酸無毒無害，且易于汞絡合，故兩種條件下，均使用L-半胱氨酸作為絡合劑。

2.3氧化劑過硫酸鉀和五氧化二釩的氧化效率的分析

以1%K₂S₂O₈-KOH溶液和1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃溶液作為氧化劑，作無機汞和甲基汞的含量分析。通過圖1和圖2可以看出，1%K₂S₂2O₈-V₂O₅-HNO₃溶液的氧化效率更高，測得的值更接近推薦值。究其原因，可能是V₂O₅在酸性溶液中的催化氧化作用，加速了汞的原子化。故本實驗采用1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃作為氧化劑。不同氧化劑測定無機汞的平行試驗見表3、表4。

2.4兩種方法的線性范圍、回收率、精密度實驗

在選定的實驗條件下，以3倍基線噪聲測定2種形態汞的檢出限（S/N=3），同時考察兩種方法的線性范圍和相對標準偏差（RSDS）（以10ng/mL的混合標準溶液平行7次進樣測定），得到了兩種方法的線性范圍、檢出限、相對標準差見表5、表6。

在高濃度范圍內25.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL、500.0ng/mL，AFS試驗方法的線性和重現性和低濃度沒有顯著差異，而在高濃度下，ICP會產生記憶效應，使得測定結果偏高，而且濃度越高記憶效應越明顯，導致標準曲線線性偏離，影響了最終測定的準確性。AFS試驗方法的精密度、線性范圍及檢出限見表7。

在優化的實驗條件下，HPLC-UV-HG-AFS測得稻谷陽性樣品中汞的總含量在267.8～353.1ng/g，甲基汞含量在32.5～43.2ng/g，占總汞含量的5.2%～8.6%。該方法的回收率在84.3%～102.1%。

綜上所述，AFS法的線性范圍較ICP-MS法的更寬。在低濃度范圍下，兩者的準確度和重現性沒有顯著差異；但高濃度時，由于含碳量高的有機相進入ICP-MS，會導致錐孔堵塞，以及ICP的記憶效應，導致檢測結果不準，故重現性和準確度不如AFS。

3結論

本文對HPLC-UV-HG-AFS和ICP-MS的前處理方法進行了比較優化，發現提取液-微波消解法可以有效地將無機汞和甲基汞提取出來，并能減少汞的損失，同時以1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃為氧化劑，進行在線紫外氧化，可以提高氧化效率，進一步提高HPLC-UV-HG-AFS測定結果的準確度。提高了測定結果的準確度。而在HPLC-ICP-MS試驗中通過避免使用鈉鉀鹽以用使用含碳量較低的甲醇，確保了檢測結果的準確度和重現性。在優化的實驗條件下，在低濃度范圍時，AFS法和ICP-MS法的精密度和準確度沒有顯著差異，均表現出優良的線性和準確性。但在高濃度下，由于ICP的記憶效應和錐孔孔徑的限制，使得HPLC-ICP-MS的線性和準確性都有一定程度的偏移。