肝癌組織中HBV感染與甲基化轉移酶表達的相關性研究*

張海濤 趙曉飛 李 寧 孫力波

首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝膽外科暨肝移植中心 (北京， 100069)

肝癌組織中HBV感染與甲基化轉移酶表達的相關性研究*

張海濤 趙曉飛 李 寧 孫力波△

首都醫科大學附屬北京佑安醫院肝膽外科暨肝移植中心 (北京， 100069)

目的：探討肝癌組織中乙型肝炎病毒感染與甲基化轉移酶表達的相關性。方法以2012年1月到2017年2月在我院診治的原發性肝癌患者178例作為研究對象，根據乙型肝炎病毒感染檢出情況分為感染組78例與非感染組100例，兩組患者都進行甲基化轉移酶MGMT的活性檢測與基因型分布PCR檢測，同時進行臨床資料的調查與相關性分析。結果感染組患者 MGMT活性為(3.45±1.46)U/ml，對照組患者為(5.14±1.89)U/ml，觀察組明顯低于對照組(t=8.341，P<0.05)。178例肝癌患者中MGMT(+)基因型65例，MGMT(-)基因型113例，兩組患者MGMT型分布頻率比較差異有統計學意義(χ2=4.985，P<0.05)。單因素分析顯示肝癌患者合并乙型肝炎病毒感染主要與吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史等明顯相關(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析顯示吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史為肝癌患者合并乙型肝炎病毒感染發生的獨立危險因素(P<0.05)。結論肝癌組織中乙型肝炎病毒感染比較常見，多伴隨有甲基化轉移酶MGMT表達活性下降，MGMT(+)基因型減少，吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史為肝癌患者合并乙型肝炎病毒感染發生的獨立危險因素。

肝癌；乙型肝炎病毒；甲基化轉移酶；相關性

原發性肝癌(PHC)簡稱肝癌，是指原發于肝臟或肝內膽管系統的惡性腫瘤，也是當前我國比較常見的惡性腫瘤[1]。肝癌在臨床上主要表現為發展迅速、起病隱匿，多數患者確診時已屬晚期，生存期短，預后很差[2，3]。手術切除是目前治療肝癌的首選方法，但由于多發病灶、腫塊過大等因素，使得術后復發率比較高，為此加強早期預防意義重大[4]。肝癌的發病因素比較多，其中乙型肝炎病毒(HBV)與丙型肝炎病毒(HCV)被認為是肝癌發生的重要危險因素，但是具體的機制還不太明確[5]。DNA修復酶-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)是近些年來發現的比較確定的造成烷化劑類化療藥物失敏或失效的一種酶，能在腫瘤細胞中呈現高表達狀況，在肝癌中也廣泛表達，其可以造成肝癌組織與細胞對烷化劑類藥的耐藥，從而直接影響到治療效果與預后狀況[6，7]。分子遺傳學研究顯示，單核苷酸多態性(SNP)是較常見的一類遺傳多態性指標，SNPs是基因序列中單個堿基變異引起編碼氨基酸發生改變，從而影響基因表達蛋白質功能的改變，這些改變將導致個體間復雜疾病的易感性差異[8～10]。本研究旨在探討肝癌組織中HBV感染與MGMT多態性的相關性，為肝癌組織中HBV感染提供科學依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年1月到2017年2月選擇在我院診治的原發性肝癌患者178例作為研究對象，納入標準：符合原發性肝癌的病理學診斷標準；臨床與病理學資料完整；甲胎蛋白(AFP)>400μg/L；研究得到醫院倫理委員會的批準。排除標準：臨床與病理資料不完整者；嚴重心、腎功能不全患者，伴有出血性疾病、出血傾向者；妊娠與哺乳期患者；精神系統疾病或長期心理壓力過大者。根據HBV感染檢出情況分為感染組78例與非感染組100例，兩組患者的性別、年齡、體重指數、肝功能分級、腫瘤直徑、病理分級等比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 MGMT表達檢測 采集兩組患者的空腹外周靜脈血3～5ml，3000r/min離心10min(離心半徑為10cm)，分離上層血清在-80℃冰箱保存。采用比色法測定血清 MGMT活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用聚合酶鏈反應(PCR)法測定 MGMT表達情況，選擇上海生工公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取血液標本中的DNA，采用PCR擴增目的基因進行基因型分析，其中MGMT引物序列為：上游5’-CTGCCCTACTTATGGATGGG-3’，下游5’-CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3’。將β-actin(519 bp)做內參證明PCR擴增有效，引物也由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，MGMT擴增片段為271bp。

PCR擴增：94℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火25s，72℃延伸30s，循環40次，72℃延伸10min，4℃保存，將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 臨床資料調查 調查所有患者的臨床與病理資料，包括年齡、性別、體重指數、乙型肝炎病毒感染、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、冠心病史、糖尿病史、高脂血癥史，記錄腫瘤直徑、病理分級、肝功能分級、甲胎蛋白等指標。

2 結果

2.1 MGMT活性對比 感染組患者 MGMT活性為(3.45±1.46)U/ml，非感染組為(5.14±1.89)U/ml，感染組明顯低于非感染組(t=8.341，P<0.05)。

2.2 MGMT多態性分析 在178例患者中，瓊脂糖凝膠電泳顯示 MGMT(+)基因型均得到一條與預期目的片段大小一致的271bp特異帶，MGMT(-)基因型無特異性條帶出現，見圖1。

注：M為maker，1、2、3、5為MGMT(+)，4、6、7為MGMT(-)

圖1 MGMT多態位點電泳圖

2.3 兩組患者MGMT型分布頻率 見表2。

表2 兩組患者MGMT型分布頻率比較 [n(%)]

2.4 相關性分析 單因素分析顯示，肝癌患者合并HBV感染主要與吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史等明顯相關(P<0.05)，見表3。

表3 肝癌組織中HBV感染單因素分析 [n(%)]

將上述指標納入多因素Logistic回歸分析，最終篩選出吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史為肝癌患者合并HBV感染發生的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 肝癌組織中HBV感染的多因素分析

3 討論

肝癌致病相關因素可大致分為外源性因素與內源性因素兩種，外源性因素主要與自然環境和生存環境相關，內源性因素則包括機體的遺傳背景、DNA損傷修復能力、免疫狀態等，其中肝炎病毒感染可能是其中最重要的因素之一[11]。相關研究表明HBV感染后，可造成肝細胞損傷，引起病程慢性化，最后導致肝組織纖維化、肝硬化，誘發肝癌形成[12]。當前已證實肝組織內存在肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞，可攻擊肝炎病毒感染的肝細胞；且肝炎病毒高水平復制可通過與肝癌細胞結合，使肝癌細胞合成甲胎蛋白的能力增強，釋放增加，從而導致血清甲胎蛋白升高[13，14]。

MGMT是分子量為22KDa的酶蛋白，能與DNA鳥瞟呤六號氧上的烷基化合物結合，使DNA上烷基化的鳥嘌呤被還原，而MGMT則成為失活的烷基化MGMT[15]。在腫瘤細胞中，MGMT分子上有兩個烷基受體，可接受烷基化損傷的細胞DNA上6-烷基鳥嘌呤上的烷基，修復被烷基化的鳥嘌呤，因而可阻止DNA交聯的形成，從而降低化療藥物的細胞毒作用[16]。本研究顯示感染組患者 MGMT活性明顯低于非感染組，表明乙型肝炎病毒感染可導致 MGMT活性降低。 SNP是在人類基因組中分布頻率超過1%的單堿基改變，是基因序列中單個堿基的變異，堿基的變異可引起編碼的氨基酸發生改變，從而影響相關蛋白質的功能。MGMT具有缺陷型(-)和功能型(+)兩種基因型，變異基因型可能引起MGMT活性發生改變[17，18]。本研究顯示178例肝癌患者中MGMT(+)基因型65例，MGMT(-)基因型113例，兩組患者MGMT型分布頻率比較差異有統計學意義。主要在于MGMT(-)基因型可產生大量無活性酶，導致機體解毒能力下降。

多因素Logistic回歸分析顯示吸煙、MGMT活性、MGMT(+)基因型、糖尿病史為肝癌患者合并乙型肝炎病毒感染發生的獨立危險因素。2型糖尿病能加重肝功能的損害，促進肝硬化進程，也加速肝硬化向原發性肝癌的轉化[19]。吸煙可使HBV感染者免疫力下降，進展為原發性肝癌的危險性明顯增高[20]。MGMT在抗誘變和抗腫瘤過程中具有重要作用，且可以通過酶促和非酶促反應解除促癌劑和脂質毒性，免除促癌因素對正常細胞的影響[21]。病毒感染患者血漿中脂質過氧化產物增加，外周血單核細胞超氧化物歧化酶活性增高，促進肝纖維化進展，也會增加發展為原發性肝癌的危險性[22]。

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ClinicalstudyonthecorrelationbetweenhepatitisBvirusinfectionandtheexpressionofmethyltransferaseinhepatocellularcarcinoma

ZHANGHai-tao,ZHAOXiao-fei,LINing,SUNLi-bo△.DepartmentofHepatobiliarySurgeryandLiverTransplantationCenter,BeijingYou-AnHospital,CapitalMedicalUniversity(Beijing,100069)China

Objective:To investigate the relationship between hepatitis B virus infection and the expression of methyltransferase in patients with hepatocellular carcinoma.MethodsFrom January 2012 to February 2017, 178 cases of primary liver cancer patients in our hospital were selected as the research object, all the cases were divided into infection group of 78 cases and non infection group of 100 cases according to the hepatitis B virus infection, two groups of MGMT methyltransferase activity and genotype distribution were given PCR detection, and the clinical data were given the investigation correlation analysis.ResultsThe MGMT activity in the infection group was (3.45±1.46) U/ml, and the control group was (5.14±1.89) U/ml, the observation group was significantly lower than the control group (t=8.341,P<0.05). In the 178 cases, there were 65 cases of MGMT (+) genotype, 113 cases of MGMT (-) genotype, there were significant differences compared between the two groups of patients with MGMT genotype distribution(χ2=4.985，P<0.05). Univariate analysis showed that patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis B virus infection were related to the smoking, MGMT activity, MGMT (-) genotype anddiabetes(P<0.05); Logistic regression analysis showed that the smoking,MGMT activity, MGMT (-) genotype and diabetes were independent risk factors for the occurrence of hepatitis B virus infection in the hepatocellular carcinoma patients.ConclusionHepatocellular carcinoma with hepatitis B virus infection is common, it accompanied by methyltransferase activity decreased the expression of MGMT .MGMT (+) genotype decreased, smoking,MGMT activity, MGMT (-) genotype and diabetes are the independent risk factors in patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis B virus infection.

Hepatocellular carcinoma; hepatitis B virus; methyltransfer-ase; correlation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.004

北京市醫院管理局臨床技術創新項目(No.XMLX201711)；△通訊作者

2017-03-28 編輯：陳盛鐸)