清腸利肝方對D-氨基半乳糖/脂多糖所致急性肝衰竭小鼠的防護作用*

張向穎 勾春燕 李 麗 李紅艷 任 鋒 李秀惠△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心 (北京 100069) 2.北京市肝病研究所

·實驗研究·

清腸利肝方對D-氨基半乳糖/脂多糖所致急性肝衰竭小鼠的防護作用*

張向穎1,2勾春燕1李 麗1李紅艷1任 鋒2李秀惠1△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心 (北京 100069) 2.北京市肝病研究所

目的探討中藥組方清腸利肝方對D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)所致急性肝衰竭小鼠的防護作用并探究其相關(guān)機制。方法將野生型健康C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常組、急性肝衰竭模型組(簡稱模型組)和清腸利肝方干預(yù)組(簡稱干預(yù)組)。模型組和干預(yù)組小鼠腹腔注射D-GalN(700 mg/kg) /LPS (10 μg/kg)誘導(dǎo)肝衰竭；干預(yù)組小鼠注射D-GalN/LPS前3天以清腸利肝方灌胃，1次/d。D-Gal/LPS給藥6小時后收集小鼠肝臟組織和血清。觀察各組小鼠肝臟損傷變化及相關(guān)炎癥分子的變化情況。結(jié)果模型組小鼠肝臟損傷嚴重，大片肝組織充血壞死；干預(yù)組小鼠肝臟損傷較模型組減輕，促炎因子水平低于模型組，MAPK通路炎癥相關(guān)蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論清腸利肝方對D-GalN/LPS所致小鼠急性肝衰竭有明顯防護作用，其機制可能與調(diào)節(jié)MAPK通路而發(fā)揮抗炎作用有關(guān)。

清腸利肝方；急性肝衰竭；炎癥

急性肝衰竭(ALF)是由炎癥介導(dǎo)的肝細胞損傷，并伴隨肝細胞凋亡和壞死的臨床綜合癥[1]，多由肝炎病毒、應(yīng)用肝毒性藥物或肝臟缺血再灌注損傷等病因引起。在臨床上多表現(xiàn)為病情危重、發(fā)展迅速、病死率很高。由于其確切發(fā)病機制并不明確，迄今在臨床上除肝移植外尚沒有特異有效的治療藥物和方法[2]。中西醫(yī)結(jié)合的方法在臨床治療肝衰竭過程中發(fā)揮了重要作用。清腸利肝方是我院協(xié)定處方，應(yīng)用臨床10多年，取得了較好的臨床效果，但具體相關(guān)機制尚不明確。本研究通過建立D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型，探討清腸利肝方的保肝作用及相關(guān)機制，為后續(xù)研究和推廣該方奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 健康C57BL/6雄性小鼠，8～12周齡，重量18～25g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，在北京市肝病研究所飼養(yǎng)，實驗前12h和實驗期間禁食，自由飲水。D-氨基半乳糖(D-GalN，700 mg/kg)，脂多糖(LPS，10 μg/kg)購自Sigma公司。p-JNK、p-ERK、p-p38和β-actin兔抗鼠單克隆抗體以及辣根過氧化酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔多克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司；增強化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Santa Cruz公司；蛋白定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司。SuperScript Ⅲ Platinum Two-step qRT-PCR試劑盒和Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司。Luminex檢測系列細胞因子試劑盒為美國Affymetrix eBioscience 產(chǎn)品。清腸利肝方所用藥物購自北京康仁堂藥業(yè)，方劑組成：生地、大黃、厚樸、蒲公英、枳殼，為水煎劑。

1.2 實驗方法 實驗分組：將30只野生型健康C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常組、急性肝衰竭模型組(簡稱模型組)、清腸利肝方干預(yù)組(簡稱干預(yù)組)，每組10只。模型組和干預(yù)組小鼠采用腹腔注射D-GalN(700 mg/kg)和LPS(10μg/kg)，均注射1次，建立急性肝衰竭模型，干預(yù)組小鼠在造模前3天灌胃清腸利肝方湯劑，劑量為0.05ml/每克體重,正常組和模型組小鼠以等量生理鹽水灌胃均1次/d。造模后6h開始收集小鼠肝組織和血清。

1.3 觀察指標 ①肝組織病理檢測： 小鼠肝組織以10%甲醛溶液固定24h以上，石蠟包埋，制備5μm組織切片，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織損傷情況。②炎癥相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測：用Trizol試劑提取肝組織總RNA，操作按說明書進行，測定總RNA濃度；用qRT-PCR試劑盒合成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR檢測，具體操作按試劑盒說明書進行。③細胞因子水平測定： 采用luminex液相芯片系統(tǒng)測定炎癥因子包括TNF-α、IL-10、CXCL-10、IL-12水平。④組織蛋白提取、濃度測定以及蛋白免疫印跡檢測：用加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液勻漿肝組織提取蛋白，離心力為8000g，4℃離心5min；取上清液進行蛋白濃度測定；蛋白免疫印跡操作如下：取蛋白樣品電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、第一抗體(1∶1000稀釋)孵育，TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔第二抗體孵育(1∶2000稀釋)，TBST漂洗后取等量的ECL發(fā)光試劑A液和B液混勻后孵育PVDF膜，壓片曝光。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠肝臟病理檢測結(jié)果 見插頁圖1。

正常組小鼠肝組織表面光滑，邊緣整齊，組織切片顯示肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，未見變性壞死等；模型組小鼠肝組織呈彌漫性炎癥壞死出血，壞死面積近2/3，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)改變，肝細胞水腫變性，廣泛壞死，炎性細胞浸潤；干預(yù)組小鼠肝臟較模型組病變明顯減輕，未出現(xiàn)融合性大塊壞死，肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細胞浸潤較少。

2.2 3組小鼠肝組織中炎癥因子基因水平檢測結(jié)果 見圖2。

圖2 3組小鼠炎癥因子基因水平檢測結(jié)果

與模型組小鼠相比，干預(yù)組小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趨化因子基因水平均降低，而炎癥抑制因子IL-10基因水平上升(P<0.01)。

2.3 3組小鼠血清炎癥因子水平檢測結(jié)果 見圖3。

圖3 3組小鼠血漿炎癥因子檢測結(jié)果

與正常組相比，模型組小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趨化因子水平上升；與模型組相比，干預(yù)組小鼠TNF-α、IL-12、CXCL-10等促炎因子和趨化因子水平均降低，而炎癥抑制因子IL-10水平上升(P<0.0001)。

2.4 3組小鼠肝組織炎癥相關(guān)蛋白免疫印跡結(jié)果 見圖4。

圖4 3組小鼠肝組織炎癥相關(guān)蛋白免疫印跡圖

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中磷酸化的JNK、ERK、和p38蛋白表達增加；干預(yù)組小鼠JNK、ERK、和p38蛋白表達降低。

3 討論

全球約有3.5億人為HBV慢性感染者，而中國有近1億人為慢性HBV感染者，其中有15%至40%未經(jīng)抗病毒治療的患者將進展為終末期肝病，如肝硬化、肝衰竭及肝癌等[1～3]，其中僅單一HBV感染性肝衰竭占肝衰竭總數(shù)的82.2%[4]。因此，我們制備了D-GalN/LPS誘導(dǎo)建立急性肝衰竭模型，以清腸利干方進行干預(yù)，以深入探討其作用機制。

肝衰竭屬中醫(yī)“急黃”、“瘟黃”范疇，毒、瘀、虛是肝衰竭的主要病機， 在中醫(yī)肝病名家錢英教授“截斷逆挽”思想指導(dǎo)下，中西醫(yī)結(jié)合中心李秀惠教授在小承氣湯基礎(chǔ)上創(chuàng)立了以解毒、活血、益氣為組方原則的“清腸利肝方”治療肝衰竭。10余年來的臨床應(yīng)用證明了其治療肝衰竭的有效性，該方口服或灌腸給藥，可顯著改善乙型肝炎肝衰竭患者腹脹、乏力癥狀，保護肝腎功能，防止肝性腦病、自發(fā)性腹膜炎等并發(fā)癥，降低病死率[5，6]。清腸利肝方作為我院協(xié)定處方在臨床上獲得了廣泛應(yīng)用，但進一步推廣需要提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究證實的明確作用機制。

本研究結(jié)果說明清腸利肝方具有明顯地防護肝臟損傷的作用。為進一步探討清腸利肝方可能的作用機制。我們對模型動物的炎癥因子水平進行了研究。促分裂素原活化蛋白激酶(MAP激酶),MAPK鏈是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細胞生長和分化，JNK和p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。觀察發(fā)現(xiàn)：模型組小鼠中，MAPK通路上磷酸化的JNK、ERK、p38水平均增加，且同時伴有TNF-α、IL-12、CXCL-10因子水平的升高，而在清腸利肝方干預(yù)后，上述MAPK通路炎癥相關(guān)蛋白磷酸化水平下降，伴隨相關(guān)炎癥因子的水平降低。這提示清腸利肝方可能通過調(diào)節(jié)MAPK通路上相關(guān)蛋白的磷酸化水平來發(fā)揮其抗炎作用。

[1] European association for the study of the liver. EASL clinical practice guidelines: management of chronic hepatitis B [J]. J Hepatol, 2009,50(2):227-242.

[2] Liu Y,Wang CM ,Cheng J,etal. Hepatitis B virus in tenofovir-na?ve Chinese patients with chronic hepatitis B contains no mutation of rtA194T conferring a reduced tenofovir susceptibility[J]. Chin Med J, 2009,122(13):1585-1586.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會重型肝病與人工肝學(xué)組.肝衰竭診治指南[J].中華肝臟病雜志, 2012,21(3):177-183.

[4] 劉曉燕，胡瑾華，王慧芬，等.1977例急性、亞急性、慢加急性肝衰竭患者的病因與轉(zhuǎn)歸分析[J]. 中華肝臟病雜志,2008,16(10):772-775.

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[6] 來要良，李秀惠，錢英. 清腸養(yǎng)肝方灌腸治療慢性重型乙型肝炎臨床觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2007,17(2)：71-72.

PreventiveeffectsofQingchangliganformulaonacuteliverfailureinmiceinducedbyD-galactosamineandlipopolysaccharide

ZHANGXiang-ying1,2,GOUChun-yan1,LILi1,LIXiu-hui1△,etal. 1.CenterforintegratedtraditionalChineseandWesternmedicine,BeijingAdventistHospital,CapitalMedicalUniversity(Beijing, 100069 )China

Objective:To investigate the protective effects of the Qingchangligan formula against acute liver failure caused by D-Gal-LPS in mice.MethodsAcute liver failure (ALF) was induced by intraperitoneal injection of D-GalN (700 mg/kg) plus LPS (10 μg/kg). The Qingchangligan formula was administered to mice in three doses of 50 mg/kg (on day 1, day 2, and day 3) prior to D-GalN/LPS injection by intragastric administration. The mice in different groups were sacrificed at 6 h after D-GalN/LPS injection, and liver samples and blood were collected for analysis.ResultsIn the model group, the mice had serious liver injury and liver necrosis. Compared with model group, pretreatment with the Qingchangligan formula reduced the expression of inflammatory cytokines by decreasing the expression of components of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway.ConclusionQingchangligan formula exerts a protective effect against the pathophysiology of ALF, especially in regulating liver inflammation.

Qingchangligan formula; acute liver failure; inflammation

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.011

國家自然科學(xué)基金(No.81473500),北京市自然科學(xué)基金(No.7132105);△通迅作者

2017-02-22 編輯：韋 怡)