銀萊湯對食積復合FM1流感病毒小鼠全血微量元素的影響

李曉菲 ，王云輝 ，甄建華 ,3，于 河 *劉鐵鋼 ，郝 鈺 ，吳 珺 ，邱澤計 ，梅沉成 ，谷曉紅 *

（1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；2.山東省樂陵市人民醫院中醫科，山東 樂陵 253600；3.中日友好醫院呼吸科，北京 100029）

銀萊湯對食積復合FM1流感病毒小鼠全血微量元素的影響

李曉菲1,2，王云輝1，甄建華1,3，于 河1*劉鐵鋼1，郝 鈺1，吳 珺1，邱澤計1，梅沉成1，谷曉紅1*

（1.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029；2.山東省樂陵市人民醫院中醫科，山東 樂陵 253600；3.中日友好醫院呼吸科，北京 100029）

目的探討銀萊湯對食積復合FM1流感病毒感染小鼠全血微量元素含量的影響，為銀萊湯藥效機制的研究提供實驗依據。方法雄性昆明小鼠80只，隨機分為正常組，食積組，感染組，食積感染組及銀萊湯高、中、低劑量組，利巴韋林組。食積組、食積感染組及各治療組均采用喂飼高蛋白、高熱量飼料結合52%牛奶溶液灌胃的方法制作食積動物模型，感染則采用FM1流感病毒滴鼻處理，并予相應的治療藥物或生理鹽水灌胃。取眼球血運用原子吸收光譜法（AAS）測定小鼠全血中微量元素（Cu、Zn、Ca、Mg、Fe）的含量。結果與正常組相比，食積組、感染組、食積感染組小鼠的銅、鋅、鈣含量增高，鎂元素含量明顯降低(P＜0.05)，食積組小鼠的鐵含量明顯降低(P＜0.05)；與食積感染組相比，銀萊湯各劑量組銅、鋅、鐵含量降低，但銀萊湯低劑量組的鈣、鎂含量升高，而銀萊湯高劑量組的鈣、鎂含量則降低，銀萊湯中劑量組的銅、鋅、鈣、鎂、鐵含量與正常組相比差異無統計學意義（P>0.05）。與利巴韋林組相比，銀萊湯各治療組鋅、鈣、鎂含量無差異，銀萊湯中劑量組銅、鐵含量明顯升高（P＜0.05）。結論食積、感染及食積復合感染因素能夠造成微量元素的紊亂，經銀萊湯治療后其微量元素水平得到一定程度的糾正。

銀萊湯；食積；FM1流感病毒；微量元素

時代的進步使得食物種類繁雜多樣，甜食、油炸類食品、果汁或碳酸飲料等各種各樣的零食及正餐替代品富含脂肪和碳水化合物，長期食用會導致飲食結構不合理，并嚴重影響人體內微量元素的吸收及其平衡[1]。現代研究證實，反復呼吸道感染患兒存在微量元素的失衡或紊亂，且患兒的體液免疫和細胞免疫也會出現某種程度的降低[2]。本課題組通過臨床觀察和前期研究，認為小兒反復呼吸道感染可能與胃腸積熱的內因相關[3]。谷曉紅教授在臨床中發現，針對平素胃腸積熱又發生呼吸系統感染的患者，采用銀萊湯清宣肺熱的同時清泄胃腸積熱，往往效果顯著。因此，本實驗通過復制食積復合感染的動物模型，檢測小鼠全血微量元素銅 （Cu）、鋅（Zn）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、鐵（Fe）的含量，明確銀萊湯對微量元素的影響，探索銀萊湯可能的起效機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明小鼠80只，雄性，3周齡，體質量（10±1）g。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，飼養于北京中醫藥大學基礎醫學院醫學病原學系動物房實驗動物潔凈柜，動物合格證號為SCXK(京)2012-0001。飼養溫度20～24℃，濕度50%～60%，自然光照，通風良好。

1.1.2 主要試劑 流感病毒亞甲型鼠肺適應株(FM1)，由北京中醫藥大學基礎醫學院醫學病原系免疫實驗室提供，經統計得出LD50的濃度為10-5.375。博暉全血/血清多元素檢測試劑 （北京博暉創新光電技術股份有限公司，產品標準編號：YZB/京1714-2012）。

1.1.3 儀器 電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DG20-002，北京中科環試儀器有限公司）、電子天平 （型號JA3003，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、博暉五元素分析儀（型號BH 5100型，北京博暉創新充電技術股份有限公司）。

1.1.4 動物飼料 普通飼料為小鼠全價顆粒飼料自制高熱量、高蛋白飼料的制作方法：奶粉、豆粉、魚松、面粉配合比例為 1∶2∶1∶1，混合后攪拌均勻，加適量水做成條索狀，狀如普通小鼠飼料，用電熱恒溫鼓風干燥箱烘干備用。52%的牛奶溶液為奶粉與0.9%無菌NaCl溶液按照13∶12的比例混合，攪拌均勻，備用。

1.1.5 銀萊湯顆粒 制備過程：蒸餾提取金銀花、魚腥草、連翹三味藥的揮發油，封口膜封好后保存于4℃；金銀花、魚腥草、連翹煎煮藥液加入其他藥物煎煮，減壓濃縮藥液成膏狀，再用恒溫水浴鍋加熱使藥液水分蒸發，后用真空干燥箱干燥至固體，最后用中藥粉碎機制成粉劑保存。使用時按照臨床用量比例折合成粉劑用量，并加入揮發油混勻后灌胃。飲片購自于北京中醫藥大學國醫堂。西藥陽性對照藥利巴韋林顆粒，四川百利藥業有限責任公司產品，批號：20120702。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組干預 雄性昆明小鼠80只，隨機分為正常組，食積組，感染組，食積感染組及銀萊湯高、中、低劑量組，利巴韋林組。正常組、感染組喂飼普通小鼠飼料，實驗第2天至第11天，用生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，每日2次。食積組、食積感染組、銀萊湯高中低劑量組及利巴韋林組第1至4天，喂飼自制高蛋白、高熱量飼料，并用52%牛奶溶液按0.2 mL/10 g灌胃，第5至第11天喂飼普通小鼠飼料。實驗第5天，正常組、食積組以50 μL生理鹽水滴鼻，感染組、食積感染組及各治療組以50 μLFM1流感病毒液滴鼻。第5日至第11日，食積組、食積感染組予生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，銀萊湯高、中、低各劑量組及利巴韋林組分別按9.168、4.584、2.292 g/kg的銀萊湯生藥量及18.75 mg/kg的利巴韋林灌胃，每日2次。

1.2.2 觀測指標 取小鼠眼球血40 μL，放入微量元素專用檢測試劑中，運用原子吸收光譜法（AAS）測定。

1.3 數據處理與統計分析

2 結果

銅元素：與正常組相比，感染組與食積感染組小鼠全血中銅元素水平明顯升高（P＜0.05）；與食積組相比，感染組、食積感染組小鼠全血中銅元素水平明顯升高（P＜0.05）；與食積感染組相比，各治療組小鼠全血中銅元素水平明顯降低（P＜0.05）；與利巴韋林組相比，銀萊湯低、高劑量組小鼠全血中銅元素水平差異無統計學意義（P＞0.05），銀萊湯中劑量組水平明顯升高（P＜0.05）。

鋅元素：與正常組相比，食積組、感染組、食積感染組小鼠全血中鋅元素水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與食積感染組相比，銀萊湯高劑量組小鼠全血中鋅元素水平明顯降低（P＜0.05），其余各治療組小鼠全血中鋅元素水平降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；各治療組小鼠全血中鋅元素水平與正常組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

鈣元素：與正常組相比，感染組小鼠全血中鈣元素水平明顯升高（P＜0.05），而食積組、食積感染組水平升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與食積組相比，感染組水平明顯升高（P＜0.05）；與食積感染組比較，感染組小鼠全血中鈣元素水平明顯升高（P＜0.05），各治療組小鼠全血中鈣元素水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

鎂元素：與正常組相比，食積組、食積感染組、銀萊湯中、高劑量組小鼠全血中鎂元素水平明顯降低（P＜0.05）；與食積感染組相比，各治療組小鼠全血中鎂元素水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

鐵元素：與正常組相比，食積組、銀萊湯低劑量和高劑量組、利巴韋林組小鼠全血中鐵元素水平明顯降低（P＜0.05）；與食積組相比，感染組與食積感染組小鼠全血中鐵元素水平明顯升高（P＜0.05）；與食積感染組相比，銀萊湯低高劑量組、利巴韋林組小鼠全血中鐵元素水平明顯降低（P＜0.05）；與利巴韋林組相比，銀萊湯中劑量組小鼠全血中鐵元素水平明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組小鼠全血中銅、鋅、鈣、鎂及鐵的水平 （±s，n=10）

表1 各組小鼠全血中銅、鋅、鈣、鎂及鐵的水平 （±s，n=10）

注：與正常組比較比較★P＜0.05；與食積組比較▲P＜0.05；與感染組比較◇P＜0.05；與食積感染組比較#P＜0.05；與銀萊湯低劑量組比較△P＜0.05；與銀萊湯中劑量組比較*P＜0.05。

組別正常組食積組感染組食積感染組銀萊湯低劑量組銀萊湯中劑量組銀萊湯高劑量組利巴韋林組F P銅/μmol·L-1 26.11±3.12 27.61±3.42 34.90±3.67★▲32.42±3.82★▲21.07±2.67★▲◇#27.65±3.02◇#△22.52±3.94★▲◇#22.87±4.83▲◇#*16.28＜0.0001鋅/μmol·L-1 61.90±10.99 63.76±7.91 65.23±4.35 68.00±4.87 64.76±9.07 64.86±4.10 60.00±8.26#63.18±7.81 0.91 0.5083鈣/mmol·L-1 1.55±0.28 1.65±0.20 1.79±0.15★▲1.59±0.12◇1.68±0.10 1.67±0.08◇1.55±0.15◇1.56±0.18◇2.23 0.0433鎂/mmol·L-1 2.07±0.25 1.87±0.15★1.94±0.08 1.89±0.08★1.93±0.18 1.88±0.07★1.84±0.13★1.95±0.26 1.65 0.1380鐵/mmol·L-1 8.80±1.32 6.81±1.64★8.88±0.49▲9.02±0.52▲7.18±2.40★◇#8.02±1.24 6.75±2.55★◇#6.45±1.79★◇#*3.73 0.0019

3 討論

銅、鋅、鈣、鎂、鐵是與人類生命活動密切相關的5種微量元素，它們不僅是機體內組織和多種酶的重要組成成分，還直接參與核酸、蛋白質等重要物質的代謝過程，廣泛地參與機體的各項生命活動。因而，它們的攝入不足或者過量均會引起機體發生一系列的病變。微量元素對免疫活性細胞具有營養和調節作用，若微量元素缺乏，可導致營養功能障礙，造成相應的免疫細胞功能降低，使機體免疫力下降，對各種疾病的易感性增加，故血液微量元素的異常得到較好的糾正，可以增強小兒機體的免疫力，抑制病毒感染的進一步加重，減少并發癥的發生，對疾病的恢復和預后有一定的積極作用。郭玉蘭等[4]研究發現人體受到病原體侵襲時，補充銅元素能顯著減少感染的機會，鋅可以增強吞噬細胞的吞噬、趨化和殺菌功能，缺鋅會導致免疫器官功能下降。T細胞功能不全，免疫反應相對也會降低，對感染性疾病的易感性增強[5]。陳海苑等[6]發現RRI（反復呼吸道感染）患兒的血清鋅水平明顯低于正常兒童，且研究提示RRI患兒血清鋅水平與血清IgG、IgA濃度及CD4/CD8含量呈明顯的正相關。Walker等[7]認為，若體內鋅含量保持正常，可使肺炎患病率下降41%。謝基靈等[8]發現，輪狀病毒腸炎患兒血清鋅水平較同齡健康兒童低，在常規治療的基礎上補充鋅制劑，能夠明顯減少腹瀉的次數和大便的排出量，縮短療程，增強療效。鈣有增強氣管/支氣管纖毛運動，提高肺吞噬細胞吞噬能力的作用，增強呼吸道的清除功能。鈣元素缺乏時，淋巴細胞的種類和亞群受到破壞，致使抗體生成障礙；缺鈣還可引起腫瘤壞死因子的缺乏，引起淋巴細胞及IL-1、IL-5、IL-6等細胞因子活性的降低，導致機體免疫功能低下而易發生感染[9]，鎂也在新陳代謝中有著重要的作用，如蛋白質和核酸合成、細胞氧化磷酸化、細胞膜的離子轉運等，鎂是體內多種生化反應的催化劑，是許多酶系統的輔助因子或激活劑，鎂可參與鈣、維生素C、磷、鈉、鉀等的代謝中[10]，鎂元素主要由腸組織進行吸收，并由腎臟進行排泄，因此，鎂元素的缺乏常與二者的功能異常相關。鐵能維持機體正常免疫功能，增強中性粒細胞殺菌和吞噬功能，而鐵元素的缺乏則可使吞噬細胞中過氧化物酶活性降低，進而誘發和加重感染。綜上所述，微量元素的變化與病毒感染性疾病的發病機制、疾病轉歸有密切聯系[11]。

本實驗結果表明，食積組小鼠全血銅、鋅、鈣含量較正常組有不同程度的升高，鎂、鐵元素的含量明顯降低，考慮微量元素銅、鋅、鈣升高與食積造模喂飼高蛋白、高營養飲食相關，但由于食積造模時間較短，因此未出現統計學差異，此與研究表明的蛋白質、脂肪會增加機體對微量元素銅、鋅、鈣的吸收利用相符合[12-13]。鎂、鐵元素的含量的降低考慮可能是由于食積因素導致機體免疫功能的異常，進而影響到血液中鎂、鐵元素的含量，而團隊前期研究中已證實食積可以通過影響機體IgM、IFN-γ、IL-4水平，從而導致機體免疫功能的失調[14]。感染組小鼠全血銅、鈣含量較正常組明顯升高，說明感染后對不同微量元素影響是不同的，經病毒感染后微量元素的升高考慮與病毒感染后的免疫應激反應相關，已有研究表明病毒感染能導致微量元素的升高[15]。食積感染組小鼠銅含量明顯升高，鎂的含量明顯降低，而鈣、鋅、鐵含量升高，考慮可能是食積與感染雙重因素的影響導致微量元素紊亂。與食積感染組相比，銀萊湯各治療組銅、鐵元素含量明顯降低，銀萊湯中劑量組的銅、鋅、鈣、鐵含量與正常組相比無統計學差異，說明銀萊湯能夠明顯調節銅、鐵元素的含量，其中以中劑量組效果更好。而銀萊湯治療組的鎂元素含量較正常組明顯降低，考慮鎂元素主要由腸組織進行吸收，而食積后胃腸消化吸收能力減弱，而銀萊湯雖為肺胃同治，但由于治療時間較短，其對胃腸消化吸收的調節不能立時見效，故其對鎂元素的調節較弱。而銀萊湯低劑量組與高劑量組的銅元素含量均低于中劑量組，且中劑量組與正常組相比無統計學差異，而高、低劑量組明顯低于正常組，說明高、低劑量組雖能明顯降低銅元素含量，但其破壞體內銅元素的正常水平，也進一步說明銀萊湯中劑量組的療效較好，能夠一定程度降低銅元素含量。銀萊湯各治療組微量元素鋅、鈣、鎂與利巴韋林組相比無統計學差異，而銀萊湯中劑量組銅、鐵含量，與利巴韋林組相比，明顯升高，此說明了銀萊湯在調節銅、鐵含量方面比利巴韋林更有優勢。

銀萊湯能夠影響微量元素變化，考慮與以下兩個方面相關，一是銀萊湯各藥物組成本身含有的各種微量元素可以適度補充或調節微量元素水平，二是銀萊湯能夠通過調節免疫功能，從而影響微量元素的水平。銀萊湯的組成包括金銀花、萊菔子、連翹、前胡、黃芩、瓜蔞、魚腥草。范文秀等[16]研究發現，金銀花、連翹、黃芩、魚腥草中含有大量微量元素，包括鉀、銅、鋅、鈣、鎂、鐵等；沈躍躍等[17]研究發現萊菔子、神曲、雞內金、隔山消4種消食類中草藥富含鐵、錳等微量元素，可用于相關微量元素缺乏癥的輔助治療，其中萊菔子中各元素含量為鐵>鋅>錳>銅；劉偉等[18]研究發現鈣、鎂、錳、銅、鋅等元素在瓜蔞籽和皮中的積累不受品種的影響，但在同一品種不同部位的含量相差較大。由此可以看出銀萊湯方藥組成中含有豐富的微量元素，這在其發揮調節微量元素的含量時起到一定的幫助作用。在團隊前期實驗研究中發現[19-21]，銀萊湯能夠明顯改善肺胃積熱證小鼠的癥狀、體征，抑制肺胃積熱證小鼠血清TNF-α的釋放，促進IL-2釋放，提示銀萊湯可以調節機體的免疫功能，對抗流感病毒導致的炎癥損傷；銀萊湯能增加肺腸黏膜分泌sIgA，適度調節細胞因子TNF-α、IL-10水平，從而增強肺、腸黏膜免疫，對肺腸黏膜免疫屏障具有保護作用，證明銀萊湯具有調節機體免疫功能的作用；陳贊剛等[22]研究發現微量元素含量不足可引起小兒免疫功能水平下降，而及時補充微量元素則可改善小兒免疫功能水平，提高小兒的免疫力；Stephensen[23]也發現機體的免疫功能和微量元素之間存在正相關；故可以認為銀萊湯可能通過調節免疫功能進而影響微量元素的含量。

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Influences of Yinlai Decoction on Plasma Trace Elements of Mice with Dyspesia Combined with FM1 Influenza Virus Infection

LI Xiaofei1,2,WANG Yunhui1,ZHEN Jianhua1,3,YU He1*,LIU Tiegang1,HAO Yu1,WU Jun1,QIU Zeji1,MEI Chencheng1,GU Xiaohong1*
(1.College of Traditinal Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Department of Traditional Chinese Medicine,Leling City People's Hospital,Leling,Shandong 253600,China;3.China-Japan Friendship Hospital of Respiratory Department,Beijing 100029,China)

ObjectiveTo explore the influence of Yinlai decoction (YD)on trace elements in blood of mice with dyspepsia combined with FM1 influenza virus infection,and identify the efficacy of YD and their potential mechanism.Methods80 male mice were randomly divided into the normalgroup,dyspepsia group,virus-infected group,virus-infected and dyspepsia group,high,middle and low dosage of YD groups,ribavirin group.A diet-induced mice model with high fat and protein intake was used to develop models of dyspepsia animal for the dyspepsia group,virus-infected and dyspepsia group,and all the groups.The mice from virus-infected group were infected with FM1 influenza virus intranasally and

corresponding therapeutic drug or physiological saline by gavage.The level of trace elements （Cu,Zn,Ca,Mg,Fe）in blood were assessed by Atomic Absorption Spectrometry (AAS).ResultsCompared with the normal group,the Cu,Zn,Ca plasma levels of dyspepsia group,virus-infected group,and virus-infected and dyspepsia group increased,while the levels of Mg decreased significantly (P＜0.05),and the plasma levels of Fe in dyspepsia group decreased significantly (P＜0.05).Compared with the virus-infected and dyspepsia group,Cu,Zn,Fe plasma levels decreased in all the YD dosage groups,while the level of Ca,Mg increased in low dosage of YD group,but decreased in high dosage of YD group.The plasma levels of Cu,Zn,Ca,Mg,Fe in middle dose of YD groups were not statistically different,compared with the normal group (P＞0.05).Analyzing the ribavirin treatment group,its Zn,Ca,Mg plasma levels were not statistically different,compared with the YD groups (P＞0.05),however the plasma levels of Cu,Fe increased significantly (P＜0.05)in middle dosage of YD.ConclusionThe factors of dyspepsia,virus infection,and virus-infection with dyspepsia can cause disorder in trace elements,and Yinlai decoction can balance the plasma levels of these trace elements.

Yinlai decoction;dyspepsia;FM1 influenza virus;trace elements

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.12.002

本文引用：李曉菲，王云輝，甄建華，于 河，劉鐵鋼，郝 鈺，吳 珺，邱澤計，梅沉成，谷曉紅.銀萊湯對食積復合FM1流感病毒小鼠全血微量元素的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（12）：1303-1307.

2017-04-06

國家自然科學基金項目(81373769)；高等學校博士學科點專項科研基金(20120013120006)；北京市教委產學研項目（1000062520040）。

李曉菲，女，碩士，主要從事運用溫病學辨治思路指導臨床相關熱證的研究。

*谷曉紅，女，教授，博士研究生導師，E-mail:guxh1003@126.com；于 河，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail:yuhe221@126.com。

（本文編輯 楊 瑛）