黃皮葉中總黃酮的含量測定

沈靜琳

（江西醫學高等專科學校，江西 上饒 334000）

黃皮葉中總黃酮的含量測定

沈靜琳

（江西醫學高等專科學校，江西 上饒 334000）

目的 確定黃皮葉中總黃酮含量的測定方法，為其質量標準的制定提供依據。方法 本試驗以蘆丁為標樣，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH系統比色法測定黃皮葉中總黃酮的含量，在510 nm波長處測定其吸收度，從而得到待測物質的總黃酮含量。結果 使用該檢測方法，蘆丁在0.008～0.056 mg/ml范圍內具有良好的線性關系（R2=0.999 1），平均回收率為95.7%，RSD=1.13%（n=6），精密度試驗RSD=0.98%，重復性試驗RSD=4.98%（n=6），測得3批黃皮葉中的總黃酮含量分別為7.56%，7.65%，7.38%。結論 該含量測定方法精密度高，結果穩定可靠，可用于黃皮葉的質量控制。

黃皮葉；總黃酮；含量測定

黃皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels]屬蕓香科，黃皮葉為其干燥葉，味苦性辛涼。《本草求原》中記載黃皮葉有“解穢除垢，退黃腫”以及解表散熱、順氣化痰的功效，常用于治療流感、瘧疾、支氣管炎等。近年來有報道稱黃皮葉醇提取物具有保肝、抑菌、抗過敏、抗氧化、抗哮喘及潛在的鎮咳祛痰等作用。有實驗表明黃皮葉水提液中有酚類和黃酮類物質，從乙醇提取物中也進一步分離鑒定出蘆丁[1]。現采用優化的超聲波法提取工藝對黃皮葉進行提取，考察以NaN02-A1（N03）3-NaOH為顯色劑，在堿性條件下于510 nm波長處測量其總黃酮含量的測定方法，以期為進一步研究黃皮葉中黃酮的藥理作用及綜合開發利用提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UFY-400型400 g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），JA2003型電子天平（上海恒平科學儀器有限公司），KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），RE-52系列旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠），HWS24型熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），GZX-9246 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），島津AY12O萬分之一托盤電子分析天平（SHIMADZU），UV1102紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）。

1.2 材料

蘆丁對照品（UV）：成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-12040302。黃皮葉粗粉：采自中山市金鐘水庫，洗凈陰干，粉碎過篩，密封置避光干燥器中保存。

1.3 試劑

無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），亞硝酸鈉（天津市福晨化學試劑廠），硝酸鋁（天津市科密歐化學試劑有限公司），氫氧化鈉（粒）（天津市福晨化學試劑廠），無水三氯化鋁（天津市福晨化學試劑廠），以上試劑均為分析純。試驗中所用水均為實驗室自制純水和蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 黃皮葉中總黃酮的含量測定方法學考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.010 0 g，置50 ml容量瓶中，加入60%的乙醇適量，采用超聲處理使溶解，放冷，加60%的乙醇至刻度，搖勻，即得（每1 ml中含無水蘆丁0.2 mg）。

2.1.2 測定波長的確定 精密量取2 ml蘆丁對照品溶液于25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應溶液為空白對照，進行240～600 nm全波段掃描。結果顯示，在510 nm處有最大吸收波長，說明可在510 nm處進行含量測定。

2.1.3 線性的測定 精密量取對照品溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml，分別置 25 ml量瓶中，各加水 6 ml，加 5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應溶液為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，再用最小二乘法進行線性回歸，以吸光值對濃度進行線性回歸分析,求得回歸方程，A=10.113C，R2=0.999 1，表明蘆丁對照品溶液濃度在0.008～0.056 mg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 精密量取蘆丁對照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，連續測6次，按吸光度計算標準偏差（SD）為0.002 42，相對標準偏差（RSD）為0.98%。

2.1.5 供試品溶液的制備 精密稱取黃皮葉粗粉1.000 g用液液萃取法脫脂后，殘渣加60%的乙醇溶解，轉移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.1.6 穩定性試驗 精密量取供試品溶液2.5 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，分別測定顯色后放置 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min供試品溶液的吸光度，按吸光度算得其在1 h內標準偏差（SD）為0.009 61，相對標準偏差（RSD）為 2.95%。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取1.000 g同一袋樣品6份，按照“2.1.5”項下方法平行操作制備6份供試品溶液，分別精密吸取6份供試品溶液各3 ml，置25 ml量瓶中，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度，按吸光度計算標準偏差（SD）為0.016 80，相對標準偏差（RSD）為4.98%。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取已知濃度的供試品溶液2.5 ml共6份，分別置25 ml量瓶中，再分別加入3 ml的0.2 mg/ml蘆丁對照品溶液，按照“2.1.3”項下方法，自“各加水6 ml”起依法測定吸光度。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率，再計算平均回收率與相對標準偏差（RSD）。計算公式：

式中：A為供試品所含被測成分量（mg），B為加入對照品量（mg），C為實測值（mg）。算得平均回收率為 95.7%，RSD為1.13%。表明該含量測定方法的誤差以及操作過程的損失較小，可靠性較高。結果見表1。

表1 黃皮葉總黃酮加樣回收率試驗測定結果

以上數據表明，采用NaN02-A1（N03）3-NaOH系統比色法測定黃皮葉中總黃酮的含量，精密度高，結果穩定可靠。

2.2 黃皮葉中總黃酮的含量測定

精密稱取1.000 g黃皮葉粗粉3份，液液萃取法脫脂后，殘渣加60%的乙醇溶解，轉移至25 ml量瓶中，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。精密量取3 ml，置25 ml容量瓶中，加水6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min；加入氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁對照品溶液同上法平行操作的相應溶液為空白對照，在最大吸收波長處測定吸光度，計算供試品中總黃酮的含量（mg/g），再按含量計算均值。計算公式：

式中：C為供試品溶液的總黃酮濃度（mg/ml），V為供試品溶液定容的體積（ml），n為稀釋倍數，W為稱樣量（g）。算得這批自制黃皮葉粗粉中總黃酮的平均含量為7.53 mg/g。結果見表2。

表2 黃皮葉中總黃酮含量測定結果

3 討論

試驗過程中，我們發現水層揮干后用甲醇難以全部溶解，后改用60%的乙醇轉移藥渣至容量瓶，并結合文獻與藥典重新制作坐標曲線，再依法進行含量測定方法的方法學考察。由黃皮葉提取液的理化檢識結果來看，具有采用此比色法的條件。

方法學考察結果也表明該方法測定結果較為準確可靠，可初步測定黃皮葉中總黃酮含量。但在回收率試驗中測得回收率偏低，可能是由于供試品溶液中某些化學成分對檢測產生了干擾，可采用雙波長分光光度法或差示分光光度法對該檢測方法進行改進[2]。用NaN02-A1（N03）3-NaOH系統比色法測定黃皮葉總黃酮含量，操作簡便，結果較為準確可靠。本試驗對3批自制黃皮葉粗粉中的總黃酮含量進行測定，結果表明其總黃酮含量較高。借鑒已往對黃皮葉黃酮濃度與其抗氧化性間關系的研究思路，以該批自制黃皮葉粗粉為原料，進一步研究黃皮葉中黃酮類化合物的藥理作用[3]，為研究黃皮葉中黃酮的藥理作用、開發利用及質量控制提供理論依據。同時，試驗表明黃皮葉中黃酮類化合物極性較大，在提取過程中，應盡量避免使用成本較高、毒性較大的有機溶劑，以減少環境污染。黃皮在廣東、廣西、云南、四川、海南等地廣泛種植，資源豐富，在食品藥品行業中有較好的應用前景，是一種實用價值很高的植物，值得開發利用與研究。

[1]趙青，李創軍，楊敬芝．黃皮葉的化學成分研究[J]．中國中藥雜志，2010，35（8）：997-999．

[2]嚴贊開．紫外分光光度法測定植物黃酮含量的方法[J]．食品研究與開發，2007，28（9）：164-167．

[3]張福平，湯艷姬，劉曉珍，等．黃皮葉黃酮類化合物的抗氧化性研究[J]．南方農業學報，2013，44（8）：1343-1346．

R927．3

A

1671-1246（2018）01-0098-03