一種適用于HPLC去除血清中干擾峰的方法

趙靜，陳才法，穆晶晶，韓瑋璐，朱成雷，申蕊

（江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州221116）

一種適用于HPLC去除血清中干擾峰的方法

趙靜，陳才法，穆晶晶，韓瑋璐，朱成雷，申蕊

（江蘇師范大學生命科學學院，江蘇徐州221116）

通過比較和優(yōu)化血清樣品制備方法，建立一種適用于HPLC去除血清中干擾峰的方法。運用鹽析法、加熱法、萃取法和有機溶劑法去除血清中干擾峰，經(jīng)HPLC分析，比較4種方法對血清中干擾峰的去除效果。結(jié)果表明乙腈沉淀法能去除血清中大部分的蛋白質(zhì)，留下很少的雜質(zhì)峰；而加熱法、萃取法和有機溶劑法均能去除血清中的雜質(zhì)峰，但是留下的干擾峰較多，不適用于血清中HPLC的其他物質(zhì)的檢測。乙腈沉淀法去除血清中的雜質(zhì)峰效果最好，干擾最小，為HPLC血清中雜質(zhì)峰的排除提供了一種優(yōu)化的方法。

HPLC；血清；雜質(zhì)峰；鹽析法；有機溶劑沉淀法；萃取法；加熱法

隨著高效液相色譜分析鑒定技術(shù)的飛速發(fā)展，高效液相色譜分析分離樣品的高純度和高濃度已越來越重要，而血清中眾多高、中豐度蛋白的存在嚴重干擾小分子蛋白質(zhì)的分離檢測和鑒定[1]。因此，更好地分離檢測復雜蛋白質(zhì)是血清中去除雜質(zhì)的關(guān)鍵。在現(xiàn)代藥物分析工作中，80%左右的工作量及研究經(jīng)費用于生物樣品的前處理及制備步驟[2]。本文基于血清中復雜蛋白質(zhì)的去除，探討了鹽析法、加熱法、萃取法和有機溶劑法去除血清中干擾峰的最優(yōu)方法，尋找一種適用于HPLC去除血清中雜質(zhì)峰的最優(yōu)方法。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品

血清，為徐州醫(yī)學院提供新生胎兒血清。

1.2 主要儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2998紫外-可見光電二極管陣列檢測器，HH-2恒溫水浴鍋（江蘇省金檀市佳美儀器廠），TGL-16高速冷凍離心機，德國賽多利斯BP211D電子天平，HG-60旋渦混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司），GM-0.33A隔膜真空泵，SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 主要試劑

乙腈、甲醇、磷酸、硫酸銨、乙酸乙酯，均為分析純；所用的三蒸水為自制三蒸水。

1.4 液相色譜檢測條件

色譜柱innoval C18，5μm，4.6×150mm；柱溫：30℃；檢測器及波長：Waters 2489 UV/Vis檢測器，278nm；流動相A：1%磷酸/水溶液（體積比），過0.22μm水系微孔過濾膜；流動相B：1%磷酸/乙腈溶液（體積比）；流動相流速：1mL/min；梯度條件：0～15min，A相從95%線性變化至55%，保持5min后，5min內(nèi)變?yōu)?5%并平衡5min，共30min。

1.5 方法

1.5.1 鹽析法去除干擾峰[3]

將0.5mL新生胎兒血清放入1.5mL離心管中，向離心管加入0.18g硫酸銨用旋渦混合器混勻，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min，吸取上清液置85℃水浴鍋蒸干后用0.5mL甲醇復溶，用旋渦混合器混合1min使其充分溶解后，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min后，取上清，用0.22μm的過濾器過濾，然后取200μL放入進樣瓶套管中，裝入進樣瓶后放入HPLC的進樣盤中，進行檢測。結(jié)果如圖2所示。

1.5.2 加熱法去除干擾峰

將0.5mL新生胎兒血上清放入1.5mL離心管中，水浴鍋溫度升至95℃時將離心管放入恒溫水浴鍋中，加熱5min后加入乙腈，后取上清，用0.22μm的過濾器過濾，然后取200μL放入進樣瓶套管中，裝入進樣瓶后放入HPLC的進樣盤中，進行檢測。結(jié)果如圖3所示。

1.5.3 萃取法去除干擾峰[4]

取0.3mL新生胎兒血清放入離心管后加入0.3mL的乙酸乙酯萃取，用旋渦混合器混勻，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min，吸取上清液置85℃水浴鍋蒸干后用0.5mL甲醇復溶，用旋渦混合器混合1min使其充分溶解后，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min后，取上清，用0.22μm的過濾器過濾，然后取200μL放入進樣瓶套管中，裝入進樣瓶后放入HPLC的進樣盤中，進行檢測。結(jié)果如圖4所示。

1.5.4 有機溶劑法去除干擾峰[5]

方法一：取0.3mL新生胎兒血清放入離心管里，加入0.3mL甲醇后用旋渦混合器混勻，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min，吸取上清液置85℃水浴鍋蒸干后用0.5mL甲醇復溶，用旋渦混合器混合1min使其充分溶解后，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min后，取上清，用0.22μm的過濾器過濾，然后取200μL放入進樣瓶套管中，裝入進樣瓶后放入HPLC的進樣盤中，進行檢測。結(jié)果如圖5所示。

方法二：取0.3mL新生胎兒血清放入離心管里，加入0.3mL乙腈后用旋渦混合器混勻，靜置1min后，16 000r/min 4℃冷凍離心10min，吸取上清液置85℃水浴鍋蒸干后用0.5mL甲醇復溶，用旋渦混合器混合1min使其充分溶解后，靜置1min后，16 000r/min4℃冷凍離心10min后，取上清，用0.22μm的過濾器過濾，然后取200μL放入進樣瓶套管中，裝入進樣瓶后放入HPLC的進樣盤中，進行檢測。結(jié)果如圖6所示。

2 結(jié)果

圖1 原血血清中檢測色譜圖

圖2 原血血清經(jīng)過硫酸銨處理過后的色譜圖

圖3 原血血清經(jīng)過加熱后經(jīng)過乙腈處理后的色譜圖

圖4 原血血清經(jīng)過乙酸乙酯萃取后的色譜圖

圖5 原血血清經(jīng)過甲醇處理后的色譜圖

圖6 原血血清經(jīng)過乙腈處理后的色譜圖

圖1為不經(jīng)處理的原血血清檢測色譜圖。各由圖對比可知，原血血清的雜質(zhì)峰較多，經(jīng)過各種方法去除后只有經(jīng)過乙腈處理后留下的雜質(zhì)峰最少，適合于后續(xù)的血清中其他樣品的檢測。

3 結(jié)論

血漿樣品前處理主要有蛋白沉淀法（PPT）、鹽析法、加熱法和液液萃取法（LLE）[3]。通過以上實驗對比可知乙腈沉淀法去除血清中的雜質(zhì)峰效果最好，干擾最小。為HPLC血清中的雜質(zhì)峰的排除提供了一種最優(yōu)化的方法。

[1]Dekker LJ,Bosman J,Burgers PC,et al.Depletion of highabundance proteins from serum by immunoaffinity chromatography:A MALDI-TOF-MS study[ J].Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,2007,847(1):65-69.

[2]劉磊.生物樣品自動化在線固相萃取—高效液相色譜分析方法學研究[D].天津:南開大學,2013.

[3]徐貴麗.天然活性成份獐芽菜苦苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究[D].天津:天津大學,2012.

[4]黃婧,錢大瑋,段金廒,等.銀荷降脂方中5種活性成分大鼠體內(nèi)藥動學研究[A].中華中醫(yī)藥學會第七次中藥分析學術(shù)交流會會議論文集[C].中華中醫(yī)藥學會,2014.

[5]王莉,張學蘭,趙資堂,等.菟絲子生制品提取物中槲皮苷在大鼠血漿的藥動學特征比較[J].中成藥,2014(2):401-404.

A kind of Suitable for HPLC to Remove Interference Peaks in Serum

Zhao Jing,Chen Cai-fa,Mu Jing-jing,Han Wei-lu,Zhu Cheng-lei,Sheng Rui
(School of Life Sciences,Jiangsu Normal University,Jiangsu Xuzhou 221116)

Objectives:By comparing and optimizing the preparation method of serum samples,a method for removing the interference peak in serum by HPLC was established.Methods:The interference peak was removed by salting out method,heating method,extraction method and organic solvent method.The removal efficiency of serum interference peak was analyzed by HPLC.Results:The acetonitrile precipitation method could remove most of the protein in the serum,leaving little impurity peak.The heating method,the extraction method and the organic solvent method could remove the impurity peaks in the serum,but the interference peak was more,does not apply to the detection of other substances in the serum HPLC.Conclusion:The acetonitrile precipitation method to remove impurities in the peak of the best results,the smallest interference.Providing an optimized method for the further elimination of impurity peaks inserumby HPLC.

HPLC;Serum;Impurity peak;Salting out Method;Organic solvent precipitation Method;Extraction Method;Heating Method

O657.72 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-0053-03

趙靜（1986—），女，河南鄧州人，碩士在讀，研究方向：生物化學與分子生物學。