超高效液相質(zhì)譜法測定人肝細胞中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素含量

陳澄，王洪梅，李小童，陶怡，張旭敏

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

超高效液相質(zhì)譜法測定人肝細胞中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素含量

陳澄1,2，王洪梅1，李小童1，陶怡1，張旭敏2

（1.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433）

為測定人肝細胞鳥氨酸循環(huán)中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸及尿素的含量，建立了該超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的分析方法。本方法采用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液作為流動相，色譜分離后直接進串聯(lián)質(zhì)譜，采用電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進行檢測。由于人肝細胞中含有大量的被測物質(zhì)，故本方法采用水作為替代基質(zhì)進行檢測，經(jīng)驗證，該方法有效、可靠，符合方法學(xué)的各項驗證結(jié)果。

L-精氨酸；L-鳥氨酸；L-瓜氨酸；尿素；鳥氨酸循環(huán)；肝細胞

近年來，有較多關(guān)于檢測精氨酸及相關(guān)代謝途徑的物質(zhì)的報道[1]。在分析方法上，有通過加入衍生劑對精氨酸等目標化合物進行衍生后用反相色譜的方法進行分析測定[2]，也有用親水作用色譜柱對其進行保留分離分析[3]，但在這些成分測定中，尿素一直未被關(guān)注。在檢測基質(zhì)上，大部分報道都集中在人和動物的血漿中，也有一些是測定內(nèi)皮細胞等其他生物樣本，關(guān)于肝細胞中這些組分的測定，從未見報道。本文旨在建立一個UPLC-MS/MS檢測方法，同時測定人肝細胞中的L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，可以直觀地看到這些物質(zhì)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC（新加坡，Waters公司）；API4000三重四極桿質(zhì)譜儀（新加坡，Sciex公司），配有電噴霧離子源；天平（CP225D，德國，賽多利斯）；超純水儀；離心機；振蕩器；移液槍；聚丙烯96孔板，2.2mL/孔。

L-精氨酸（L-Arg）標準品，純度大于99.5%；L-鳥氨酸（L-Orn）標準品，純度大于99.0%；L-瓜氨酸（L-Cit）標準品，純度大于98%；尿素（Urea）標準品，純度大于98.5%；內(nèi)標，L-精氨酸-13C6鹽酸鹽（L-Arg-13C6）標準品，純度大于99.0%；冷凍人肝細胞（十個供體，混合性別，BioreclamationIVT）；Williams’E培養(yǎng)液（Gibco,Invitrogen）；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨，均為色譜純；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

將L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素用甲醇溶解并配制成10mmol/L標準儲備液。用50%甲醇水溶液將L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸分別配制成中間濃度工作液，濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000μmol/L；尿素用50%甲醇水溶液配制成40、80、160、320、640、1 280、2560、4 000μmol/L中間濃度工作液，然后將這4種標準品配制到水中成混合標準溶液，L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的最終標準溶液濃度 為 0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100μmol/L，尿素的標準溶液濃度為2、4、8、16、32、64、128、200μmol/L。

取100μL樣品加入400μL含有1μmol/L L-精氨酸-13C6內(nèi)標的0.1mol/L檸檬酸甲醇水溶液（v∶v=80∶20），將樣品板充分混合均勻后，在4℃條件下4000r/min轉(zhuǎn)速離心20min，取上清液100μL置于新的96孔板中，加入300μL乙腈，充分搖勻后，用于分析。

1.3 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱子（2.1mm×100mm，1.7μm)；柱溫：40℃；進樣量：4μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.6mL/min，梯度洗脫程序為：0～1.0min，保持95% B相；1.0～3.5min，B相由90%線性遞減至60%；3.5～4.0min，保持60% B相，4.0～4.5min，B相由60%遞增至95%，4.5～5.5min，保持95% B相。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；電噴霧電壓為5.5kV；氣簾氣為20kPa；霧化氣為50kPa；輔助加熱氣為60kPa；離子源溫度為600℃；碰撞氣為10V；入口電壓為10V；碰撞室出口電壓為15V；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

本文結(jié)合自身實驗室條件，比較了幾種不同組成成分的流動相：（1）A相 0.3%甲酸水溶液，B相0.3%甲酸乙腈溶液；（2）A相0.1%甲酸水溶液，B相0.1%甲酸乙腈溶液；（3）A相 0.3%甲酸和10mmol/L醋酸銨水溶液，B相0.3%甲酸和10mmol/L醋酸銨水/乙腈（v∶v,5∶95）溶液；（4）A相10mmol/L醋酸銨水溶液，B相純乙腈。

結(jié)果表明，在（3）條件下，尿素?zé)o法獲得很好的峰形，3種氨基酸的峰形略有拖尾；在（4）條件下，3種氨基酸拖尾較為嚴重，尿素的基線響應(yīng)較高，都不太適合用于分析。條件（1）和（2）中，4種物質(zhì)均能獲得較好的峰形和響應(yīng)信號，且差異不大，考慮到條件（2）更節(jié)約試劑，也方便配制，故最終選擇條件（2）作為液相條件。

2.2 樣品沉淀劑的選擇

本實驗測定的是肝細胞鳥氨酸循環(huán)中4種組分的含量，如何徹底終止該循環(huán)，準確測定細胞中這4種組分的含量成為其又一難點。本實驗采用蛋白沉淀提取法，分別考察了純乙腈、純甲醇、含10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）的甲醇溶液、含1%甲酸的甲醇溶液和含有0.1mol/L檸檬酸的甲醇水溶液（v∶v=80∶20）等不同溶劑的沉淀效果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有用0.1mol/L檸檬酸甲醇水溶液作為沉淀劑時，能測到肝細胞中4種組分的含量，且加標質(zhì)控樣品均符合要求。而使用其他4種沉淀劑，都無法測到樣品中L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的含量，推測使用這些沉淀劑不能很好的提取到細胞內(nèi)的這幾種物質(zhì)或是無法使細胞內(nèi)的鳥氨酸循環(huán)徹底終止。

2.3 方法的線性范圍、準確度和精密度

該方法中，L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸的線性范圍為0.50～100μmol/L，尿素的線性范圍為2.00～200μmol/L。標曲采用線性回歸，L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的校正曲線決定系數(shù)（R2）分別為0.994 76、0.995 15、0.995 74、0.992 94。校正曲線圖如圖1～4所示。

圖1 L-精氨酸校正曲線

圖2 L-鳥氨酸校正曲線

圖3 L-瓜氨酸校正曲線

圖4 尿素校正曲線

該分析方法中L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的定量下限分別達到0.5μmol/L、0.5μmol/L、0.5μmol/L和2μmol/L，具有足夠的響應(yīng)和良好的信噪比。尿素的本底基線雖然較高，但其定量下限的信噪比也可達到5以上，滿足分析要求。四種物質(zhì)的定量下限色譜圖如圖5～8所示。

圖5 L-精氨酸定量下限色譜圖

圖6 L-鳥氨酸定量下限色譜圖

圖7 L-瓜氨酸定量下限色譜圖

圖8 尿素定量下限色譜圖

本方法用水作為替代基質(zhì)來定量分析人肝細胞中化合物，故分別做了兩組質(zhì)控樣品考察其準確度和精密度，見表1和表2。第一組質(zhì)控樣品為設(shè)置低中高3個標準品濃度（L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸的濃度為1.5、20、80μmol/L，尿素的濃度為6、40、160μmol/L）配制在水中，每個濃度6個平行，通過與理論值的偏差來計算其準確度，通過6個平行樣品的變異系數(shù)來評估精密度。第二組質(zhì)控樣品為在復(fù)蘇后的人肝細胞（細胞濃度為1×106cells/mL）中加入低中高3個濃度的標準品（濃度同第一組），每個濃度6個平行樣品，用于評估其準確度和精密度。

表1 第一組質(zhì)控樣品的準確度和精密度結(jié)果

表2 第二組質(zhì)控樣品的準確度和精密度結(jié)果

結(jié)果表明在兩組質(zhì)控樣品中，所有樣品的準確度在85.27%～113.94%，相對標準偏差在2.17%～4.28%，均在允許范圍內(nèi)，符合分析要求，證明該方法可成功應(yīng)用于人肝細胞中的含量檢測。

3 結(jié)論

本分析方法簡便，穩(wěn)定、可重現(xiàn)，符合方法學(xué)的各項驗證。該方法首次測定了人體肝細胞中的L-精氨酸、L-鳥氨酸、L-瓜氨酸和尿素的含量，為人體內(nèi)尿素循環(huán)的相關(guān)后續(xù)科學(xué)研究提供了堅實的基礎(chǔ)。

[1]JMartens-Lobenhoffer,SMBode-Boger.Mass spectrometric quantification of L-arginine and its pathway related substances in biofluids:the road to maturity[J].Journal of Chromatography B,2014,964:89.

[2]Iole Maria Di Gangi,Lino Chiandetti,Antonina Gucciardi,et al.Simultaneous quantitative determination of NG,NG-dimethyl-l-arginine or asymmetric dimethylarginine and related pathway's metabolites in biological fluids by ultrahigh-performance liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry [J].Analytica Chimica Acta,2011,677(2):140-148.

[3]CMBrown,JOBecker,PMWise,et al.Simultaneous determination of 6 L-arginine metabolites in human and mouse plasma by using hydrophilic-interaction chromatogramphy and electrospray tandem mass spectrometry[J].Clinical Chemistry,2011,57(5):701.

Determination of L-Arginine,L-Ornithine,L-Citrulline and Urea in Human Liver Cells by Ultra Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry

Chen Cheng1,2，Wang Hong-mei1,Li Xiao-tong1,Tao Yi1,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXi Apptec,Shanghai 200131;2.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433)

In order to determine the content of L- arginine,L- ornithine,L- citrulline and urea in ornithine cycle of human liver cells,an UPLC-MS/MS method was developed for the determination of ornithine arginine in human liver cells.This method uses ACQUITY UPLC BEH Amide column with 0.1% formic acid aqueous solution and 0.1%formic acid acetonitrile as mobile phase chromatography direct tandem mass spectrometry with electrospray ion source and positive ion multiple reaction monitoring mode detection.As human liver cells contain a large number of tested substances,this method uses water as an alternative substrate for detection.The method is proved to be effective and reliable,and conforms to the validation results of the methodology.

L- Arginine;L- Ornithine;L- Citrulline;Urea;Ornithine cycle;Hepatocytes

O657.63 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-0055-04

陳澄（1985—），女，上海人，本科，研究方向：新藥研發(fā)。