基于iTRAQ技術的中醫實熱“上火”血清蛋白質組學特征分析

陳 娟 徐 莉 謝冠群 周 佳 謝志軍 甘 靜 范永升

(浙江中醫藥大學基礎醫學院，杭州，310053)

基于iTRAQ技術的中醫實熱“上火”血清蛋白質組學特征分析

陳 娟 徐 莉 謝冠群 周 佳 謝志軍 甘 靜 范永升

(浙江中醫藥大學基礎醫學院，杭州，310053)

目的：篩選實熱“上火”血清差異表達蛋白，為實熱“上火”機制的深入研究提供科學依據。方法：采用相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)對血清蛋白質進行檢測，結合生物信息學分析(GO、STRING)篩選實熱“上火”與正常非“上火”人群差異顯著的蛋白質。結果：與正常對照組比較，實熱上火組血清篩選出49個差異蛋白質，其中上調的22個，下調的27個。載脂蛋白C3(Apo C3)、乳酸脫氫酶(LDH)和維生素K依賴蛋白S(PROS1)等顯著上調，而載脂蛋白A4(Apo A4)、超氧化物歧化酶3(SOD3)和纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)等顯著下調。結論：觀察組脂質代謝、糖酵解異常與氧化應激、炎性反應的發生密切相關，且凝血功能下降，易造成出血，篩選的差異蛋白可為實熱“上火”的生物學基礎研究提供依據。

實熱上火；iTRAQ；血清蛋白質組學；生物標志物

“上火”是對身體出現口瘡、鼻衄、牙宣、目赤、咽痛、口干便秘等癥狀的統稱，發生率較高，且與口腔潰瘍、失眠癥等多種常見病的發病密切相關[1]。《素問·陰陽應象大論》“壯火食氣”“少火生氣”，論述了火的不同作用；火為熱之極、熱為火之漸，火熱同類，常連在一起。《素問·至真要大論》病機十九條，其中9條涉及“火、熱”病機，強調了火熱致病的重要性。現代醫學對“上火”還沒有統一認識，認為“上火”與機體免疫功能失調情況下出現的局部感染、應激狀態下機體內環境失衡及能量代謝等相關，醫學上也稱之為應激性疾病[2-3]。隨著社會的發展和亞健康觀念的提出，人們的健康意識不斷提高，現代醫學對上火尚缺乏有效的治療方法，而中醫學分別采用清熱瀉火法、滋陰降火法等治療，療效較為明顯，但是中醫注重宏觀觀察，缺乏對“上火”科學內涵的認識。因此，運用現代的科學技術方法來研究“上火”發生機制，不僅能夠豐富其科學內涵，同時對于防治“上火”和提高人們的健康水平也有著重要的現實意義。

生命活動的功能執行者是蛋白質，絕大多數生命調控過程、各種代謝過程、疾病的原發過程以及大多數藥物作用靶標均發生在蛋白質水平。現階段，血清蛋白質組學的研究越來越受到國內外的關注，血清中含有的蛋白質種類很多，只有不斷進行篩選和鑒定，才能進一步幫助探明疾病的發生、監控疾病的進程和每個階段相應蛋白表達水平的關聯性及規律性[4]。相對和絕對定量同位素標記(iTRAQ)技術自開展以來，在疾病研究和藥物監測方面應用廣泛，其不但可以檢測出更多的低豐度蛋白，甚至可以靈敏的檢測到其他技術無法檢測到的跨膜蛋白，具有高靈敏度、高分辨率、標記效率高、樣品兼容性和重復性好等優點，在血清蛋白質組學的研究中被廣泛應用[5-6]。

本研究以在校大學生為研究對象，基于iTRAQ技術對實熱“上火”和健康人群血清中蛋白質進行檢測，并結合生物信息學方法挖掘觀察組與正常非“上火”人群的差異蛋白，尋找其物質基礎和可能的分子標志物，為“上火”機理的深入研究提供依據，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2014年10月浙江中醫藥大學在校大學生43例，分為觀察組(實熱“上火”人群)和對照組(正常非“上火”人群)，其中觀察組21例，對照組22例,其中的一般資料如圖1[7]所示，年齡及性別比較，差異無統計學意義(P>0.05),具有統計學意義。促凝管采集血液樣本，30 min內以3 000 r/min離心，分離血清后于-80 ℃保存。

圖1 實熱上火組與正常對照組的年齡和性別比較

注：control:正常對照組，SH：實熱上火組，(a)實熱上火組與正常對照組的年齡比較，(b)實熱上火組與正常對照組的性別比較。與正常對照組比較，*P>0.05

1.2 診斷標準 采用專家咨詢法，通過多輪的專家咨詢，確定的“上火”的診斷標準：1個主癥(頭面部癥狀)或2個次癥(至少1個為頭面部癥狀)。其中“上火”頭面部主癥：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡(顏面部皰疹)、口苦、目赤干澀；“上火”頭面部次癥：口角糜爛、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齒衄、痤瘡、聲音嘶啞、頭痛；非頭面部癥狀：大便干結、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發作、潮熱、失眠[7]。

1.3 納入標準 實熱“上火”的納入標準為：1)1個主癥+舌象或脈象，其中主證為：眼眵或痰或涕等分泌物增多、黃稠，發熱或惡熱、目赤、面紅、牙齦腫痛、大便秘結；舌脈為舌紅苔黃燥、脈數有力[7]。2)平和質健康人群(作為正常對照組)，符合《中醫體質分類與判定》[8]中平和質的判定標準；3)年齡18～60周歲；4)自愿參加本實驗研究并同意簽署臨床研究知情同意書者。

1.4 排除標準 1)不符合納入標準者；2)合并精神病、腫瘤、自身免疫性疾病以及系統靶器官嚴重病變等疾病的患者；3)妊娠及哺乳期的婦女；4)研究中認為有任何不適宜入選的情況[7]。

1.5 試劑與儀器 iTRAQ試劑盒(Applied Biosystems，Foster city，CA，USA)，胰蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)。Agilent MARS-14柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)，旋轉真空濃縮器RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，旋轉真空濃縮器(RVC 2-25，Christ，Osterode，Germany)，聚乙烯基柱(2.1×100 mm，5 μm，200 μm;Nest Group，Inc.，Southborough，MA，USA)，ZORBAX 300SB-C18柱(5 μm，200?，0.1×150 mm，Microm，Auburn，CA，USA)，Triple TOF 5600系統(Applied Biosystems)。

1.6 方法

1.6.1 酶解與iTRAQ標記 將每組樣本的血清混合，根據iTRAQ試劑盒說明書對各組血清樣品進行iTRAQ標記。為了富集低豐度蛋白，使用Agilent MARS-14柱去除14種高豐度蛋白，包括白蛋白，IgG和觸珠蛋白等，然后蛋白質被濃縮和脫鹽，通過Bradford方法定量蛋白質樣品的洗脫液。將每組的蛋白質樣品(100 μg)還原，烷基化，并用胰蛋白酶在37 ℃下消化過夜。正常對照組和實熱上火組分別應用115和118試劑標記。

1.6.2 MS/MS鑒定與數據分析 iTRAQ試劑將2個樣品組混合，脫鹽和干燥。通過強陽離子交換(SCX)液相色譜法使用聚乙烯基柱將iTRAQ-標記的肽分段。總共收集10個SCX組分，濃縮并溶解。隨后加載樣品到ZORBAX 300SB-C18柱。組件進行SCX色譜法到MS分析2次。峰面積的比率的iTRAQ報告離子反映了相對豐富的肽和蛋白質。蛋白使用ProteinPilotTM軟件(Applied Biosystems，Version 4.2)進行鑒定和定量，使用ProGroup算法識別肽，MS/MS數據通過人類國際蛋白指數數據庫(HIPI，version 3.87)搜索[9-10]。統計分析以組間表達差異>1.5(上調)或<0.5(下調)，且以P<0.05為差異有統計學意義，篩選差異蛋白質。

圖2 數據采集的實熱“上火”血清蛋白生物標志物分析

注：(A)生物過程;(B)細胞成分;(C)分子功能;(D)COG功能分類;(E)通過String軟件分析的蛋白質網絡作用圖

1.6.3 生物信息學分析 差異表達蛋白質的細胞組分，分子功能和生物學過程通過Gene Ontology(GO)數據庫進行分析，相互作用網絡通過STRING軟件分析(http://string-db.org/)分析，相互作用可信度為0.9(可信度最大值為1)，并且將鑒定到的蛋白質和COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins蛋白相鄰類的聚簇)數據庫進行比對，預測這些蛋白質可能的功能并對其做功能分類統計。

2 結果

2.1 血清蛋白質組鑒定分析結果 使用iTRAQ-2D LC-MS/MS篩選對照組與實熱“上火”組差異蛋白，實驗重復2次，2次鑒定結果中共有蛋白質取2次鑒定的平均值，分別鑒定的以當次結果為準。使用R程序包TopGO，選取P<0.05的富集結果，使用string database進行分析，相互作用可信度為0.9。

2.2 觀察組與對照組血清差異表達蛋白 進一步篩選到觀察組與對照組間49個差異表達蛋白，包括22個表達上調蛋白(>2.0倍，P<0.05)(表1)和27個下調蛋白(<0.5倍，P<0.05)(表2)。見表1-2。GO富集分析差異化表達的蛋白質主要參與單一生物過程(10.17%)、刺激應答(9.18%)和生物調節(8.44%)(圖2A)此外，蛋白質集中定位于細胞(15.42，15.42%)和細胞器(12.08%)(圖2B)，多數具有結合(51.19%)、催化活性(17.86%)酶調節活性(11.90%)(圖2C)。該COG功能分類圖顯示：蛋白質功能主要集中在次生代謝產物生物合成、轉運、分解代謝(7個蛋白質)(圖2D)。蛋白質相互作用網絡圖集中指向纖溶-凝血-補體系統，以及脂質代謝異常(圖2E)。

2.3 血清差異蛋白篩選與鑒定 觀察組與對照組存在顯著差異的49個蛋白質中，經過篩選鑒定，發現和“上火”病證相關的主要差異蛋白有載脂蛋白(ApoC3、ApoA4)、補體蛋白(C4A，C4BPA)、炎性因子(SAA1、CRP)、凝血功能相關因子類(PROS1、A1AT、PAI-1)、糖酵解相關酶LDH及抗氧化蛋白酶SOD3等。

3 討論

表1 實熱“上火”與正常人群相比顯著上調的差異蛋白質(22個)

表2 實熱“上火”與正常人群相比顯著下調的差異蛋白質(27個)

載脂蛋白是一類家族較龐大的蛋白，包括A、B、C、E族等，脂質必須和載脂蛋白結合才能正常轉運，與脂質代謝的平衡息息相關。載脂蛋白(Apo)C3和A4基因，它們是ApoA1/C3/A4/A5基因簇的成員，在脂質代謝中起重要作用，其多態性變異可導致高脂血癥，是心血管疾病的易感因素。ApoC3是有效抑制VLDL-TG水解作用的重要因子，濃度升高見于代謝綜合征、動脈粥樣硬化等，是形成心血管疾病的危險因子。ApoC3也能激活NF-κB和單核細胞，促進各種炎性反應和導致動脈粥樣硬化。ApoA4參與乳糜微粒合成和分泌，并參與膽固醇逆向轉運，是高密度脂蛋白(HDL)和乳糜微粒(CM)的主要成分，具有抗炎和抗動脈硬化的屬性，是一種重要的“內源性”抗氧化劑[11]。C反應蛋白(CRP)是機體在理化因素、腫瘤、外傷、感染等刺激下由肝臟合成而產生的急性時相反應蛋白，可反映疾病嚴重程度和轉歸情況，感染或非感染性炎性反應時血清CRP明顯升高，因此常常作為診斷感染的生物學指標[12]。綜上所述，結果顯示觀察組CRP和ApoC3顯著上調，ApoA4顯著下調，說明觀察組的脂質代謝異常，抗炎、抗氧化能力降低與炎性反應的發生密切相關。

超氧化物歧化酶(SOD)在機體中作為重要的防御體系，能消除新陳代謝過程中產生的有害物質，其有3種亞型：胞質內的SOD1、線粒體內SOD2及細胞外Cu/Zn-SOD(SOD3)[13]。Cu/Zn-SOD因其重要的生理功能和巨大的治療潛能，被認為是超氧化物歧化酶家族最重要的一類酶。研究表明Cu/Zn-SOD具有抗血管生成和抗炎作用，可通過阻止免疫細胞浸潤和抑制白細胞與血管內皮細胞黏著參與免疫應答，其不僅可作為一種抗氧化劑，而且還能作為信號傳播的一個控制器，參與信號傳導。目前通過基因敲除和轉基因越來越多的研究結果揭示，SOD3與衰老、高血壓、糖尿病、細胞凋亡與增生等相關[14-16]。本研究發現觀察組SOD3表達顯著降低，推測實熱“上火”引起的炎性反應、抗氧化能力降低等癥狀與SOD3的變化密切相關。觀察組多發生局部炎性反應，如口腔潰瘍、牙齦炎等，本課題代謝組學結果發現，患者血中乳酸出現上調，推測炎性反應部位物質分解代謝加快，組織耗氧量增加，局部出現微循環障礙，影響氧供應，引發無氧糖酵解增強，釋放的乳酸未能及時被清除，在血液中堆積[7]。乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，廣泛存在于機體各種組織中，其中以心肌、骨骼肌和腎臟含量最為豐富，當組織細胞受到炎性反應等損傷時會釋放到細胞外，導致血中含量明顯增加。本研究發現LDH表達顯著升高，結合同批次人群代謝組學結果乳酸含量的升高，證實實熱“上火”情況下糖酵解增強。

此外，研究觀察組炎性反應及免疫相關差異蛋白均存在于凝血與補體級聯反應信號通路，是內源性凝血激活途徑和經典補體激活途徑的重要調節蛋白。在細胞信號傳導中蛋白并不是孤立存在的，眾多的蛋白在同一條生化反應途徑中執行各自的生理功能，不同的蛋白信號通路通過媒介又相互聯系，在凝血與補體級聯反應信號通路中，補體C4具有中和病毒的生物學活性，可水解為C4A、C4B，它們在補體活化、促進吞噬、防止免疫復合物沉著和中和病毒等方面發揮作用。補體C4BP是一種可溶性血漿糖蛋白，是補體激活經典途徑中一個重要調節蛋白[17]。維生素K依賴蛋白S(PROS1)是參與補體活化過程調控的一種血漿蛋白質，PROS1能與C4BP結合，參與補體活化，補體的過度(異常)活化可以引起炎性反應及組織損傷。同時PROS1也是一種抗凝血因子，可以作為輔因子激活蛋白C，抑制血液凝固[18]。SERPINA1基因編碼的蛋白α1-抗胰蛋白酶(A1AT)的升高能夠抑制凝血酶活性，抑制血纖維蛋白凝血酶原的生成，從而抑制纖維蛋白凝塊降解[17]。SERPINE1基因編碼的蛋白纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)是纖溶酶原激活劑tPA和uPA的主要抑制劑，是纖溶系統的主要調節因子，PAI-1不僅在纖溶過程和在維持凝血和纖溶的動態平衡中有作用，在體內許多的生理過程中都有作用，例如能抑制蛋白的降解，如凝血、結締組織演變、補體激活、炎性反應過度反應等[19-20]。PAI-1表達降低可引起纖溶(酶)活性異常增強，影響凝血功能，造成出血，說明觀察組的凝血功能下降。

綜上所述，觀察組的癥狀可能通過纖溶-凝血-補體級聯反應信號通路引起，該信號通路上的差異蛋白可作為“上火”生物學基礎研究的潛在靶點。另外該信號通路間接激活炎性反應，載脂蛋白、SOD3的變化引起抗氧化能力降低可能是實熱“上火”表征的另一路徑或靶向治療的關注點。

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AnalysisofSerumProteomicsFeaturesof“Shanghuo”inTraditionalChineseMedicineBasedoniTRAQTechnology

Chen Juan, Xu Li, Xie Guanqun, Zhou Jia, Xie Zhijun, Gan Jing, Fan Yongsheng

(CollegeofBasicMedicalSciences,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310053,China)

Objective:To screen differentially expressed proteins in excessive heat “shanghuo” serum and provide a scientific basis for in-depth study on the mechanism of excessive heat “shanghuo”.MethodsSerum proteins were detected by relative and absolute quantitative isotope labeling (iTRAQ), and bioinformatics analysis (GO, STRING) was used to screen the proteins that were significantly different between the normal fever group and normal non-lit group subjects.ResultsCompared with the normal control group, 49 differentially expressed proteins were screened by excessive heat “Shanghuo” group, with 22 up-regulated and 27 down-regulated. Apolipoprotein C3 (Apo C3), lactate dehydrogenase (LDH), and vitamin K-dependent protein S (PROS1) were significantly up-regulated while Apo A4, SOD3 and the plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) and so on were significantly down-regulated.ConclusionThe abnormal lipid metabolism and glycolytic abnormality in the “shanghuo” crowd are closely related to the occurrence of oxidative stress and inflammation, and the coagulation function is decreased, leading to easily bleeding. The differential proteins screened can provide references for biological foundation of basic research on “shanghuo”.

Excessive heat; iTRAQ; Serum proteomics; Biomarker

R22;R24

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.008

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目(2014CB543001)；973計劃子課題(2014CB543001-1)；浙江中醫藥大學基礎醫學院科技創新團隊項目(JCIT2016-1)

陳娟(1984.09—)，女，博士，副教授，研究方向：中西醫結合防治疑難病，E-mail：mytw_00@163.com

范永升(1955.11—)，男，博士，教授，國家重點學科帶頭人，研究方向：中醫藥防治風濕自身免疫病，E-mail:fyszjtcm@163.com

(2017-11-03收稿 責任編輯：張文婷)