降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1表達的影響

莫芳芳 劉海霞 華 靜 趙丹丹 田 甜 高思華

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京，100029)

實驗研究

降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1表達的影響

莫芳芳1劉海霞1華 靜2趙丹丹1田 甜1高思華1

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京，100029)

目的：通過研究降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1因子表達的影響，探討降糖消渴顆粒含藥血清保護胰島β細胞的分子機制。方法：通過慢病毒轉染的方法制備FoxO1高表達INS-1穩定細胞株，以2.5 μg/mL四環素干預12 h誘導FoxO1高表達以成模。以10%的降糖消渴顆粒含藥血清干預細胞模型24 h，正常鼠血清作對照。高倍鏡下觀察細胞形態，MTT法計算細胞存活率，全自動生化儀檢測細胞培養液中葡萄糖含量以計算葡萄糖消耗量，Elisa法檢測細胞胰島素分泌量，Western blot檢測細胞中FoxO1總蛋白表達水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR檢測FoxO1mRNA表達情況。結果：高倍鏡下觀察細胞形態、細胞存活率均無統計學意義。降糖消渴顆粒含藥血清組葡萄糖消耗量與細胞胰島素分泌量均顯著升高(P<0.01)。Western-blot結果顯示FoxO1總蛋白表達無統計學意義(P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表達增加(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示FoxO1mRNA表達量稍有降低，但差異沒有統計學意義(P>0.05)。結論：降糖消渴顆粒含藥血清不能降低INS-1細胞FoxO1蛋白表達水平，但能促進FoxO1磷酸化，進而達到改善胰島β細胞功能的作用。

降糖消渴顆粒；FoxO1；INS-1細胞；2型糖尿病

Forkhead(Fox)因子是一類蛋白質家族，其在生物體內起著重要作用，已經成為生命科學研究的熱點之一[1]。目前發現Fox有17個亞族，FoxO是其中之一。FoxO主要通過轉錄調控和信號傳導途徑來調節動物的生長發育、細胞分化、代謝、凋亡、炎性反應和免疫等[2]。FoxO1是FoxO家族中發現最早的成員，它能促進脂肪細胞的分化[3-4]、負調控骨骼肌的生成和Ⅰ型肌纖維基因的表達[5]，且對肝細胞、胰島β細胞及脂肪細胞中胰島素作用的發揮起重要作用[6]。《CELL》發表的研究結果表明FoxO1與胰島β細胞去分化相關，是維持β細胞身份的最主要作用因子[7]。

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是一種復雜的遺傳因素和環境因素共同作用所致的內分泌代謝性疾病。胰島β細胞數目減少及功能受損是T2DM發生發展的最重要病理生理基礎之一。降糖消渴顆粒是在導師肝脾腎同調辨治糖尿病大法指導下所組方劑，其臨床療效確切[8]。實驗研究也已經證實降糖消渴顆粒含藥血清可抑制大鼠胰島β細胞瘤株INS-1凋亡[9]。為進一步研究降糖消渴顆粒治療T2DM的作用機制，本研究擬從FoxO1切入，通過體外培養INS-1細胞，慢病毒轉染制備FoxO1高表達模型，再以降糖消渴顆粒含藥血清干預，探討其對β細胞FoxO1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性8周齡SD大鼠30只，體重(300±20)g，購自北京維通利華實驗動物中心(合格證號：SCXK(京)2012-0001)。INS-1細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院細胞資源中心。

1.1.2 藥物 降糖消渴顆粒的成藥顆粒劑型由北京中醫藥大學中藥學院中藥科技發展部生產及提供，已經過質量鑒定，每克顆粒含5.01 g生藥，藥物樣品均保存于北京中醫藥大學糖尿病研究中心實驗室內(4 ℃保存)，以備未來參考。臨用時用蒸餾水配成相應濃度的混懸液[10]。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養基，購自INVITROGEN公司；胰蛋白酶，購自SOLARBIO公司；胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司；青/鏈霉素，購自HYCLONE公司；RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自北京普利萊基因技術有限公司；MTT購自Sigma公司；大鼠胰島素(INS)ELISA kit，購自武漢華美生物工程有限公司；FoxO1(C29H4)Rabbit mAb購自CST公司；Anti-FOXO1A(phospho S256)antibody購自ABCAM公司，RNeasy Mini Kit，購自QIAGEN公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自FERMENTAS公司；FG，POWER SYBR GREEN PCR，購自INVITROGEN公司；PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。CO2培養箱、熒光定量PCR儀：美國Thermo公司；超凈臺工作：香港Heal Force公司；酶標儀：瑞士Tecan全波長多功能酶標儀；顯微鏡、AU400全自動生化分析儀：日本OLYMPUS公司；電泳和轉膜裝置、XRS凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備方法 雄性8周齡SD大鼠30只，體重(300±20)g，按體質量隨機分組如下：空白對照組10只，降糖消渴顆粒組20只，給藥劑量為52.8 g生藥/(kg體重·d)(相當于臨床人公斤體質量用量的60倍)進行灌胃，每天上、下午各灌胃1次，共5次。空白對照組只灌胃等量的蒸餾水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，無菌條件下經腹主動脈取血，4 ℃靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，分離含藥血清。合并同組大鼠含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-80 ℃保存備用[11]。

1.2.2 INS-1細胞培養 INS-1細胞以含10%胎牛血清(FBS)，100 IU/mL青霉素，100 IU/mL鏈霉素，50 μmol/Lβ-巰基乙醇的RPMI-1640完全培養基置于37 ℃，5% CO2條件下無菌培養24 h更換培養基一次，待細胞密度達到70%～80%后進行細胞傳代。

1.2.3 INS-1細胞FoxO1高表達模型的建立及鑒定 構建含有FoxO1基因片段的質粒載體，應用慢病毒轉染的方法將其轉入INS-1細胞，經puromycin篩選獲得穩定表達FoxO1細胞株(OE)和陰性對照細胞株(NC)，2.5 μg/mL Doxycycline干預12 h誘導FoxO1表達。用qRT-PCR檢測NC、OE 2種細胞株FoxO1基因的表達情況，以對模型進行鑒定。

圖1 FoxO1相對基因的表達

注：與NC組比較，**P<0.01

OE組FoxO1基因的表達豐度是NC組的2.05倍，NC組相對RNA水平是(1.003±0.089)，OE是(2.050±0.213)，有明顯的統計學意義，說明FoxO1基因轉染成功，模型建立成功。

1.2.4 藥物干預及指標檢測 以10%的降糖消渴顆粒含藥血清[9]干預細胞模型24 h，正常鼠血清作對照。分別檢測正常組、模型組、藥物組細胞培養液中的葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量，MTT法檢測吸光度，計算細胞存活率，Elisa法檢測細胞胰島素分泌量，Western blot檢測細胞中FoxO1總蛋白表達水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR檢測FoxO1mRNA表達情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據處理分析，每組實驗重復3次，數據均以Mean±SE表示，2組比較采用t檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態觀察 在高倍鏡下觀察，正常組、模型組和降糖消渴顆粒組的細胞呈梭形或多邊形，細胞核明顯，細胞形態基本相似(如圖2)。結果顯示，慢病毒轉染造模和10%降糖消渴顆粒含藥血清干預細胞均不會造成細胞形態的變化。

圖2 細胞形態(200×)

2.2 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞葡萄糖消耗量及細胞存活率的影響 檢測細胞培養液中葡萄糖含量，與未接種細胞的空白復孔的葡萄糖濃度相減，算出各孔的葡萄糖消耗量。結果如圖3所示，與正常對照組比較，模型組的細胞葡萄糖消耗量明顯減少(*P<0.01)，差異有統計學意義。與模型對照組比較，10%降糖消渴顆粒含藥血清能夠增加FoxO1高表達INS-1細胞模型的葡萄糖消耗量(**P<0.01)。

MTT法測定波長在570 nm各孔的吸光度,計算細胞存活率。如圖3所示，各組之間細胞存活率無顯著性差異(#P>0.05，##P>0.05)，說明慢病毒轉染制備FoxO1高表達模型與10%降糖消渴顆粒含藥血清干預細胞均未見明顯細胞毒性。

2.3 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞胰島素分泌功能的影響 如圖4所示，與正常組比較，INS-1細胞FoxO1高表達模型組的細胞胰島素分泌量減少，差異有統計學意義(*P<0.01)，提示FoxO1高表達INS-1細胞胰島素分泌功能受損。與模型組比較，10%降糖消渴顆粒含藥血清能夠明顯增加細胞胰島素分泌量(**P<0.01)。

圖3 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞葡萄糖消耗量及細胞存活率的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，#P>0.05，與模型組比較，**P<0.01，##P>0.05

圖4 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞胰島素分泌功能的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，**P<0.01

2.4 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1蛋白表達及其磷酸化水平的影響 如圖5所示，Western-blot結果顯示，與正常INS-1細胞比較，FoxO1高表達細胞模型組FoxO1總蛋白表達增加(#P<0.01)，p-FoxO1蛋白表達無統計學意義(*P>0.05)，提示模型穩定。應用10%降糖消渴顆粒含藥血清干預24 h后，與模型對照組比較，FoxO1總蛋白表達無統計學意義(##P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表達增加(**P<0.05)。

圖5 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1、P-FoxO1蛋白表達的影響

注：與正常組比較，*P>0.05，#P<0.01，與模型組比較，**P<0.05，##P>0.05

2.5 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1 mRNA表達的影響 如圖6所示，qRT-PCR結果顯示，與正常組比較，模型對照組FoxO1mRNA表達量明顯升高(*P<0.01)，提示細胞模型穩定。以10%降糖消渴顆粒含藥血清干預FoxO1高表達INS-1細胞模型24 h，與模型對照組比較，FoxO1基因表達量稍有降低，但差異沒有統計學意義(**P>0.05)。

圖6 降糖消渴顆粒含藥血清對INS-1細胞FoxO1 mRNA表達的影響

注：與正常組比較，*P<0.01，與模型組比較，**P>0.05

3 討論

胰島素抵抗和胰島β細胞受損是T2DM發病的重要病理機制，尤其β細胞數量減少和功能受損在T2MD發生和發展中發揮了重要作用。大量研究資料表明，FoxO1在胰島β細胞中表達豐富，FoxO1作用于協調β細胞的更新和功能之間的關系，是胰島β細胞應激、增殖、凋亡調控網絡的關鍵點[12-17]。

FoxO1的活性受胰島素的負性調節。FoxO1作為胰島素/胰島素樣生長因子1(INS/IGF-1)信號通路中的關鍵因子，其上游受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)磷酸化級聯通路的調節。FoxO1分子中有三個保守的AKT/PKB蛋白激酶的磷酸化位點，PI3K/AKT途徑被激活后，使細胞核中的FoxO1磷酸化而發生核輸出，由核內轉至胞質中，失去轉錄活性，從而抑制細胞的凋亡。當胰島素信號減弱時，通過PI3K/AKT通路，AKT/PKB蛋白激酶活性降低，使FoxO1磷酸化水平降低而滯留在細胞核內，失去活性，進而通過誘導靶基因表達而導致細胞功能的改變[18]。

在我們的研究中發現FoxO1高表達的INS-1細胞的葡萄糖消耗量和胰島素分泌量均有所降低，提示FoxO1高表達導致了INS-1細胞分泌胰島素的功能受損。降糖消渴顆粒含藥血清能夠增加胰島β細胞的葡萄糖消耗量和胰島素分泌量，從而改善了細胞功能。進一步研究分子機制，FoxO1高表達INS-1細胞中總的FoxO1蛋白水平和mRNA均顯著增加，說明慢病毒轉染的細胞模型穩定。經降糖消渴顆粒含藥血清干預，細胞中總的FoxO1蛋白水平和mRNA含量均無顯著性變化，而P-FoxO1蛋白水平增加，說明降糖消渴顆粒含藥血清促進了β細胞中FoxO1磷酸化出核，可能激活PI3K/AKT途徑，從而改善細胞胰島素分泌功能。這可能是降糖消渴顆粒含藥血清保護胰島β細胞、改善細胞功能的作用機制之一。

綜上所述，FoxO1因子在β細胞中發揮著重要作用，本研究表明了降糖消渴顆粒不能降低FoxO1蛋白水平，但能促進FoxO1磷酸化，進而改善β細胞的胰島素分泌功能，然而降糖消渴顆粒是否通過激活PI3K/AKT通路而發揮作用，還需進一步實驗證實。

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EffectsofJiangtangXiaokeGranuleContainedSerumonFoxO1ExpressioninINS-1Cell

Mo Fangfang1, Liu Haixia1, Hua Jing2, Zhao Dandan1, Tian Tian1, Gao Sihua1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicineThirdAffiliatedHospital,Beijing100029,China)

Objective:To study the molecular mechanism of Jiangtang Xiaoke Granule contained serum in protecting β-cells through studying the effects of Jiangtang Xiaoke Granule (JTXK) contained serum on FoxO1 expression in INS-1 cell.MethodsLentivirus transfection was used to prepare FoxO1-overexpressing INS-1 stable cell line, and the overexpression was induced by 2.5 μg/mL doxycycline for 12 hours. The cells were treated with 10% JTXK granule containing serum for 24 h. And normal rat serum was used as control. The morphological changes of cells were observed under high power microscope. MTT analysis was used to calculate cell viability. The glucose concentration in cell culture was detected by automatic biochemical analyzer. And the glucose consumption was calculated. ELISA analysis was used to examine insulin secretion. The expression levels of FoxO1 and P-FoxO1 were evaluated by western blot. And the expression levels of FoxO1mRNA were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).ResultsThe cells did not have significant differences in size and shape. And there was no difference in cell viability among three groups. The glucose consumption and insulin secretion were increased in JTXK group (P<0.01). At the same time, the results of western-blot and qRT-PCR showed that the expression of FoxO1 and FoxO1mRNA had no difference (P>0.05). However, the expression of P-FoxO1 was increased (P<0.05).ConclusionJTXK granule cannot decrease the expression of FoxO1 of INS-1 cell, but can promote phosphorylation of FoxO1, so as to improve β-cell function.

Jiangtang Xiaoke (JTXK) granule, FoxO1, INS-1 cell, Type 2 diabetes mellitus (T2DM)

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.047

北京中醫藥大學中青年教師自主選題項目(2015-JYB-JSMS015)

莫芳芳(1982.03—)，女，博士，助理研究員，研究方向：臟腑相關理論研究與中醫藥防治糖尿病研究，E-mail：xiaofang.tcm@163.com

高思華(1957.07—)，男，博士，教授，研究方向：運氣學說、臟腑相關理論研究與中醫藥防治糖尿病研究，Tel：(010)64286915，E-mail：sihuagaopaper@sina.com

(2017-07-21收稿 責任編輯：徐穎)