黃芪注射液聯合葛根素注射液對2型糖尿病動物KKAy小鼠心臟組織IRE1α和XBP1表達的影響

張淑靜 王 謙 李姝玉 趙福建 王巖飛 高譽珊 李奕萱 張 達

(北京中醫藥大學中醫學院，北京，100029)

黃芪注射液聯合葛根素注射液對2型糖尿病動物KKAy小鼠心臟組織IRE1α和XBP1表達的影響

張淑靜 王 謙 李姝玉 趙福建 王巖飛 高譽珊 李奕萱 張 達

(北京中醫藥大學中醫學院，北京，100029)

目的：探討黃芪注射液聯合葛根素注射液對2型糖尿病動物KKAy小鼠的心臟保護作用機制,為中醫藥治療糖尿病心肌病提供實驗依據。方法：將造模成功的KKAy小鼠按血糖隨機分為模型組和觀察組(黃芪注射液聯合葛根素注射液),同周齡雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組,并于20周齡、24周齡、28周齡分別處死小鼠。熒光定量PCR測小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1U、XBP1S的表達，蛋白免疫印跡檢測小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1蛋白的表達。結果：模型組小鼠20、24、28周齡心臟組織IRE1α的 mRNA和蛋白表達比正常組明顯增加(P<0.01)，觀察組20周齡IRE1α蛋白表達較正常組增加(P<0.01)，但觀察組各周齡IRE1αmRNA和蛋白表達均低于模型組(P<0.01或P<0.05)；模型組小鼠各周齡XBP1S mRNA和XBP1蛋白表達、28周齡XBP1U的mRNA表達比正常組增加(P<0.01或P<0.05)，觀察組各周齡XBP1蛋白表達和20、24周齡的XBP1S mRNA表達較模型組降低，而28周齡XBP1S和XBP1U的mRNA表達均分別比模型組和正常組增加(P<0.05)。結論：黃芪注射液聯合葛根素注射液可在一定程度上抑制2型糖尿病動物KKAy小鼠心臟組織中內質網應激信號分子IRE1α和XBP1的表達,減輕內質網應激，保護2型糖尿病KKAy小鼠的心臟功能。

黃芪注射液；葛根素注射液；糖尿病心肌病；內質網應激

我國2型糖尿病(T2DM)的發病率呈現逐年顯著升高的趨勢。糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并發癥之一，其發病與糖尿病的代謝紊亂密切相關。患者心肌細胞出現細胞凋亡、心肌肥大和心肌纖維化等原發性損傷，從而引起廣泛的心肌結構異常，最終可導致心肌收縮和(或)舒張障礙[1-3]。目前研究顯示，內質網應激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)參與了糖尿病心臟病變的發生發展過程，并且起著非常關鍵的作用[4-6]。

黃芪注射液，是中藥黃芪全提取物的水溶液，經滅菌制成，主要成分有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸及其他微量元素。現代藥理研究表明，黃芪可以增強免疫功能，具有保肝、利尿；降壓、調脂、降糖等作用。葛根素是葛根注射液的有效成分，它是從葛根中分離提取出來的一種異黃酮類單體化合物，據現代藥理研究發現，葛根素能改善微循環、心腦血管循環，降血壓，保護心肌細胞，抗血小板聚集等作用。中藥組方在防治糖尿病及其并發癥方面具有很大優勢，有著標本兼顧的優勢，已有許多中藥組方成功開發并應用于臨床糖尿病的治療，取得良好的效果[7]。我們在前期研究中[8]，發現黃芪注射液聯合葛根素注射液對T2DM動物KKAy小鼠腎臟過強的ERS反應有很好的抑制作用，本研究以此小鼠為模型，探討黃芪注射液聯合葛根素注射液對糖尿病心臟病變發生發展過程中有關的ERS有關因IRE1α和XBP1表達的影響，為探討黃芪葛根注射液通過IRE1途徑抵抗ERS，保護糖尿病心肌病小鼠心臟功能，為臨床新藥的研發與應用提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級KKAy小鼠和C57BL/6J小鼠，雄性，鼠齡8～10周，體重22～25 g，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，動物合格證號：SCXK(京)2013-0002，適應性飼養7 d，自由飲水和進食。高脂飼料(10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+67%基礎飼料)購自北京科澳協力飼料有限公司，普通飼料購自中國醫學科學院動物中心。

1.1.2 藥物 葛根注射液(批號：1009056，成都地奧九泓制藥廠)，黃芪注射液(批號：1404163，湖南五洲通藥業有限責任公司)，TRIzol購自Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自Promega生物技術有限公司，Power Sybrgreen購自ABI公司，引物設計應用Primer5軟件設計并交由寶生物工程(大連)有限公司合成；蛋白裂解液、電泳液，電轉液等試劑購置北京普利萊基因技術有限公司，兔抗IRE1α、XBP1抗體購自Abcam公司，二抗購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM動物KKAy小鼠模型的建立 用高脂飼料喂養KKAy小鼠，用普通飼料喂養C57BL/6J小鼠，全部給予普通飲水。待12周齡時，將隨機血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠視為糖尿病模型建立成功[9]。

1.2.2 實驗動物分組及給藥 實驗分為對照組、模型組、觀察組，將C57BL/6J小鼠作為對照組，將造模成功的KKAy小鼠按隨機血糖隨機分為模型組和觀察組，具體分組情況如下：對照組：C57BL/6J小鼠，18只，給予普通飼料飼喂。模型組：KKAy小鼠，18只，給予高脂飼料飼喂，每日給予與觀察組相同劑量的生理鹽水(4.3 mL/kg)，腹腔注射。觀察組：KKAy小鼠，18只，給予高脂飼料，每日腹腔注射黃芪注射液(3 mL/kg)和葛根素注射液(1.3 mL/kg)，2種藥物先后注射。以上各組動物均為單籠飼養，均自由飲食，普通飲水，每日換墊料，分別于20周齡、24周齡、28周齡各處死6只，檢測相關指標。

1.2.3 心肌組織樣品采集和制備 分別于20周齡、24周齡、28周齡時分批處死各組小鼠，用剪刀打開小鼠胸腔，將心臟剪下，以冰生理鹽水沖洗殘留血液，去除大血管，快速切留心尖組織，保存于液氮罐中備用。

1.2.4 熒光定量PCR檢測 用TRIzol試劑提取心臟組織的RNA，反轉錄后，用熒光染料POWER SYBRGREEN進行實時熒光定量PCR實驗，PCR反應體系為20 μL：其中SYBRGREEN 10 μL、上游、下游引物(10 μM)各0.4 μL，cDNA為反轉錄原液(20 μg RNA)稀釋后2 μL、ddH2O 7.6 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s(讀取熒光數值)，共40個循環。熔解曲線：擴增循環結束后，95 ℃，15 s，60 ℃(讀取熒光數值)，1 min，然后從60 ℃至95 ℃，每增加0.3 ℃，讀取一次吸光值，最后95 ℃，15 s。讀取Ct值，計算△Ct值(Ct目的基因-Ct內參actin)、△△Ct值(△Ct處理-△Ct對照)、2-△△Ct值(相對表達量RQ，Relative Qualification)，并進行統計學分析。

1.2.5 Western Blot檢測心臟組織IRE1α、XBP1蛋白的表達 提取心臟組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量變性蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，120 V，100 min電泳，80 V，70 min轉膜，然后于5%脫脂奶粉/TBST中，室溫封閉至少1 h，加入一抗稀釋液稀釋的兔抗小鼠IRE1α、XBP1抗體(1∶1 000)，孵育、洗滌，再加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)，于暗室中顯影。膠片蛋白質條帶用Quantity One成像分析系統分析。以吸光度值代表蛋白的強度，以目的蛋白與內參照蛋白β-actin的吸光度值的比值作為目的蛋白表達相對量。

2 結果

2.1 各組小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1U、XBP1S的mRNA表達水平 IRE1α的mRNA表達，20周齡、24周齡、28周齡，模型組與正常組比較，均顯著增加，觀察組比模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。XBP1U的mRNA表達，在20周齡和24周齡，模型組與正常組無統計學意義，在28周齡時，模型組與正常組比較，表達明顯增高，有統計學意義(P<0.05)。在20周齡、24周齡、28周齡時，觀察組比正常組、模型組都增加，都有統計學意義(P<0.05)。XBP1S的mRNA表達，在20周齡時，模型組比正常組增加，有統計學意義(P<0.05)，觀察組與正常組、模型組均無統計學意義；在24周齡時，模型組比正常組增加，有統計學意義(P<0.01)，觀察組與正常組無統計學意義，比模型組明顯較少(P<0.01)；在28周齡時，模型組與觀察組比正常組均顯著增加(P<0.01)，而觀察組與模型組比較表達顯著增高(P<0.05)。

表1 20周齡各組小鼠目的基因mRNA表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 24周齡各組小鼠目的基因mRNA表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表3 28周齡各組小鼠目的基因mRNA表達情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.2 各組小鼠心臟組織中IRE1α、XBP1蛋白的表達情況 IRE1α蛋白表達，20周齡時，模型組和觀察組均比正常組顯著增加(P<0.05)，觀察組比模型組減少(P<0.05)。24周齡、28周齡，模型組與正常組比較，均顯著增加(P<0.01)，觀察組比模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。XBP1蛋白表達，20周齡時，模型組比正常組顯著增加(P<0.01)，觀察組與模型組比較無統計學意義；24周齡、28周齡時，模型組比正常組顯著增加(P<0.01)，觀察組比模型組顯著增加(P<0.01)，但與正常組比較無統計學意義。

圖1 20周齡、24周齡、28周齡各組小鼠目的基因mRNA表達情況

圖2 20周齡、24周齡、28周齡各組小鼠目的蛋白表達情況

3 討論

T2DM是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂綜合征，這種代謝的紊亂可引起心肌細胞的能量代謝障礙，最終導致心臟功能和結構的異常。KKAy小鼠是一種理想的人類T2DM動物模型。實驗中，經過高脂飼料喂養后，KKAy小鼠的血糖會持續維持較高水平，表明了該動物模型的穩定性。

糖尿病心肌病變于1974年由Hamby等首先提出，其作為糖尿病的一種獨特的心臟并發癥目前已得到公認，其主要病理改變為心肌細胞肥大、凋亡、壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細胞外間質有不溶性膠原蛋白積聚和纖維化。代謝出現異常、左室增厚、細胞外基質發生變化、心肌微血管的病變、氧化應激反應、形成胰島素抵抗、發生細胞凋亡均是重要的促進因素，皆參與到了糖尿病心肌病變的發生、發展過程。研究顯示，ERS參與了糖尿病心臟病變的發生發展過程[10-12]，并且起著非常關鍵的作用。ERS主要效應通路有IRE1通路、PERK通路、ATF6通路3條[13]，其中涉及到的因子更是繁多，共同調控ERS介導的細胞凋亡過程。IRE1α是一種轉膜蛋白，未折疊蛋白在內質網腔內積聚刺激IRE1α跨膜域寡聚化及位于細胞質的C-端效應域自身磷酸化。活化的IRE1α在哺乳動物中可以剪切XBP1的mRNA，IRE1α通過降解自身RNA對其自身表達也有調節作用。生理狀態下，XBP1蛋白與非折疊蛋白及ERAD基因的促進子結合促進內質網穩態，具有保護細胞，避免凋亡的作用。活化的IRE1通過非常規的剪接形式，切除非剪接型XBP1(XBP1U)上26個核苷酸使之轉化成剪接型XBPl(XBPlS)。XBPlS是XBP1的活性形式，它可以進入細胞核內與未折疊蛋白反應元件(Unfolded Protein Response Element，UPRE)相結合，激活大量目的基因表達[14-15]。有報道稱，許多基因是XBP1的目標基因，它們的表達是通過細胞依賴方式或是條件依賴方式來調控的。這些目標基因包括一系列與DNA損傷、修復有關(如氧化還原動態平衡、氧化應激反應)的基因。有研究發現，通過使XBP1發生高表達[16-17]，證實XBP1的下游基因大多為內質網高爾基體系統組成部分、內質網相關降解系統(ER Associated Degralotion，ERAD)或內質網分子伴侶。有研究發現，染色體上XBP1的結合位點有407個，相關目的基因有545個，其中大量基因與UPR目的基因相關[18]，因此說明XBP1對恢復內質網功能和維持內質網的蛋白質折疊動態平衡非常重要。

本研究Real Time PCR檢測中擴增曲線與溶解曲線顯示，各個目標基因都進行了正常轉錄，Real Time PCR檢測各目標基因的RQ值統計分析顯示，IRE1α，20周時，模型組比正常組顯著增加，觀察組比正常組有所增加，但比模型組減少，有統計學意義；24周和28周趨勢與20周一致，只是28周觀察組與正常組比較，沒有統計學意義。XBP1S和IRE1α不同，它是ERS激發后繼而活化的因子，它們的mRNA的表達在20周時，觀察組與正常組和模型組基本無統計學意義，說明藥物在早期對ERS后續因子的抑制作用不明顯。早期主要是作用于IRE1α，從而抑制ERS的發展。當24周和28周時，觀察組基因表達量相比模型組有了顯著減少，說明藥物對XBP1S也起到了很好的抑制作用，從而抑制了ERS，抑制細胞凋亡的發生。XBP1U是XBP1S的前體形式，被IRE1α剪切之后形成XBP1S，當ERS發生激烈時，XBP1U大量轉錄，同時也大量被剪切，所以基本與正常組水平無統計學意義，但當IRE1α受到藥物的抑制作用時，被剪切的前體就會減少，所以，觀察組的XBP1U就會增多，本實驗結果數據也顯示如此。Western blotting實驗結果顯示，各目標基因的蛋白表達量與PCR結果完全吻合，mRNA表達量增多/減少，蛋白的表達量也是增多/減少。

據以上討論分析，本實驗用實驗數據證實在糖尿病心臟病變過程中，發生了心肌細胞的凋亡，該凋亡過程與ERS的發生與發展有關。黃芪注射液與葛根素注射液聯用可能通過抑制ERS從而抑制心肌細胞的凋亡，進而減緩糖尿病心臟病變的發展。

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EffectsofHuangqiInjectionCombinedwithPuerarinInjectiononKKAyMicewithDiabeticCardiomyopathyonEndoplasmicReticulumStress

Zhang Shujing, Wang Qian, Li Shuyu, Zhao Fujian, Wang Yanfei, Gao Yushan, Li Yixuan, Zhang Da

(SchoolofChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To investigate the cardioprotective mechanism of Huangqi injection combined with puerarin injection on KKAy mice with diabetic cardiomyopathy, providing experimental evidence for the treatment of diabetic cardiomyopathy using traditional Chinese medicine. Methods KKAy mice were randomly divided into model group and treatment group (Huangqi injection combined with puerarin injection) according to blood glucose. The male C57BL/6J mice with same age were used as normal control group. The mice were sacrificed at 20, 24 and 28 weeks old, respectively. qRT-PCR was used for detecting the mRNA expression of IRE1α, XBP1U and XBP1S and Western blotting was used for assaying the expression of IRE1α and XBP1.ResultsThe mRNA and protein expression of IRE1α in the model group increased at 20, 24 and 28 weeks, while the increase of mRNA and protein expression of IRE1α reduced in the treatment group at 20, 24 and 28 weeks. The difference was statistically significant (P<0.05). The mRNA and protein expression of XBP1S at 20, 24 and 28 weeks and the mRNA expression of XBP1U at 28 weeks was increased in the model group; For the treatment group, the mRNA expression of XBP1S at 20 and 40 weeks and protein expression of XBP1 was down-regulated, whereas the expression of XBP1S and XBP1U mRNA increased. The difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionHuangqi injection combined with puerarin injection could inhibit the expression of IRE1α and XBP1, two stress signaling molecules of endoplasmic reticulum in the heart tissue of KKAy mice, and reduce the endoplasmic reticulum stress and exert cardioprotective effect on KKAy mice with type 2 diabetes.

Huangqi injection; Puerarin injection; Diabetic cardiomyopathy; Endoplasmic reticulum stress

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.048

北京市高校教師青年英才計劃項目(YETP0794)

張淑靜(1984.09—),女,碩士,實驗師，E-mail：zhangshujing@bucm.edu.com

李姝玉(1978.07—)，女，博士，副教授，研究方向:中醫藥對糖尿病及其并發癥的防治研究,E-mail：lishuyu0716@163.com

(2017-08-31收稿 責任編輯：徐穎)