缺氧條件下GDF-15對心肌微血管內皮細胞成管的影響

尚小森，衛(wèi)兵艷，劉田福，陳小平*

(1.太原市中心醫(yī)院心內科，山西 太原 030009；2.山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001）

缺氧條件下GDF-15對心肌微血管內皮細胞成管的影響

尚小森1，衛(wèi)兵艷2，劉田福2，陳小平1*

(1.太原市中心醫(yī)院心內科，山西 太原 030009；2.山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物和人類疾病動物模型山西省重點實驗室，山西 太原 030001）

目的 通過缺氧發(fā)生裝置將心肌微血管內皮細胞（CMECs）進行缺氧，轉染GDF-15相關病毒，觀察其對CMECs成管的影響。方法 將CMECs分為五組：空白對照組、GDF-15siRNA轉染組、干擾對照組、過表達GDF-15組、過表達對照組，以上各組在缺氧發(fā)生裝置中進行缺氧干預，Western blot測定各組細胞GDF-15蛋白的表達情況。通過內皮細胞成管實驗，觀察各組在缺氧條件下CMECs管腔結構形成情況。結果 過表達組較其他組GDF-15蛋白表達明顯增加，干擾組明顯降低，缺氧條件較常氧，CDF-15表達增高。缺氧6h時CMECs過表達GDF-15組在Matrigel Matrix上形成管腔結構，而GDF-15siRNA轉染組及對照組均未形成管腔結構。結論 缺氧條件能促進CMECs中 GDF-15的表達，GDF-15能夠促進CMECs增殖及血管新生，為GDF-15在急性心肌梗死側支循環(huán)方面的研究奠定了基礎。

急性心肌梗死；側支循環(huán)；心肌微血管內皮細胞；生長分化因子-15

目前，人們在精神及生理方面承擔著越來越大的壓力與責任，這與當今社會逐漸加快的工作節(jié)奏密不可分，冠狀動脈疾病也隨之逐漸增多，給國家?guī)砭薮蟮纳鐣摀⒃斐蓢乐氐尼t(yī)療資源消耗及勞動力損失。其中，急性心肌梗死則為頭號殺手，它是由于冠狀動脈血管壁的痙攣或狹窄、閉塞所致，隨病情進展，嚴重時可致心力衰竭[1]。急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction AMI），是在冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的基礎上，產生冠脈急性血栓栓塞所致。對于冠心病，尤其是急性心肌梗死的有效預防和及時治療已成為目前心血管疾病領域的重要研究課題。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（AMI）冠脈血流閉塞時，尤其是發(fā)病3～6 h內的心梗患者，其側支血管的形成對梗死面積的大小起至關重要的調節(jié)作用，良好的側支循環(huán)可以維持AMI相關區(qū)域心肌的活性，可有效保護心功能，對患者的臨床預后及生活質量有極大的改善[2]。新生血管是維持病理或正常組織血液供應的重要機制之一，在急性心肌梗死時，對心肌細胞缺血、缺氧所產生的癥狀亦具有明顯改善作用，其中，側支循環(huán)的建立則尤為重要[3]。并且它是心肌以及其他臟器對于組織缺血產生的應答和自我保護機制。

2006年發(fā)表在Circulation Research的兩項研究首先報道了生長分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF-15），TGF-β超家族成員之一，在缺血性心臟疾病中發(fā)揮著重要的保護機制[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15參與了缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion）損傷后缺血心肌的修復。隨后，大量報道顯示：GDF-15是多種心源性疾病重要的診斷marker和預后指標，故此，在缺血缺氧微環(huán)境中的GDF-15水平變化，以及GDF-15如何調控心肌細胞存活，血管新生以及改善心臟功能的基礎方面驗證研究尚不明確。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國的Gibco公司；GDF-15 siRNA慢病毒、過表達GDF-15慢病毒購于Elabscience生物科技有限公司；Anti-GDF15抗體（兔單克隆抗體）抗體購于美國abcam公司；GDF-15引物及β-actin引物均于美國Gene Copoeia公司構建。

1.2 細胞來源

心肌微血管內皮細胞（CMECs）購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

取CMECs復蘇后在37℃下、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法，按1∶3分瓶傳代。

1.3.2 細胞進行病毒轉染及分組

CMECs分5組：正常CMECs為空白對照組、GDF-15siRNA轉染組、干擾對照組、過表達GDF-15組、過表達對照組。轉染8 h后將各組細胞換液，每組各加2ml高糖完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待轉染72 h后用嘌呤霉素進行抗性篩選。繼續(xù)培養(yǎng)細胞、傳代。再將以上5組分為細胞缺氧模型制備組及常氧組。

1.3.3 Western blot測定各組細胞在常氧及缺氧6h GDF-15蛋白表達情況

處理后的細胞用PBS緩沖液清洗干凈，用含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰上裂解30 min，12000×g離心25 min（4℃），收集上清液。BCA法測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%的濃縮膠和15%的分離膠進行跑膠，轉膜，用5%BSA封閉2 h，一抗4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，二抗室溫孵育2h，TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，洗凈，顯色，掃描。

1.3.4 CMECs體外成管實驗

用預冷的槍頭將基質膠在冰上以每孔50 μl鋪于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，之后每孔加入100 μl的細胞懸液（2×104/孔）。按照5個分組處理細胞6 h后，觀察各組細胞管狀排列狀況及管狀結構數(shù)量、完整程度，并隨機選取5個視野，應用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野小管數(shù)量，結果以與正常組相比的百分數(shù)表示。

2 結 果

2.1 各轉染組CMECs72 h后的生長情況如下圖所示（圖1）

GDF-15過表達組細胞生長明顯比其他組快，GDF-15siRNA組明顯比其他組慢。

2.2 對各組細胞進行缺氧處理，如下圖所示（圖2）

觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧12 h時90%以上細胞已壞死，因此取缺氧時間點為6 h。

2.3 常氧及缺氧6 h，各組GDF-15的表達情況

進行病毒轉染后，觀察常氧及缺氧6 h時各組細胞GDF-15蛋白的表達情況：GDF-15過表達組實現(xiàn)了GDF-15過量表達，GDF-15siRNA轉染組實現(xiàn)了GDF-15的低表達，且缺氧后各組GDF-15蛋白表達量較常氧時均有所增加，缺氧刺激了GDF-15的表達。

2.4 缺氧6h時，CMECs成管實驗結果

GDF-15過表達組的CMECs細胞在Matrigel Matrix上形成管腔結構，而GDF-15siRNA組及對照組均未形成管腔結構。如圖4。

圖1 病毒轉染72 h，各組CMECs生長情況

圖2 缺氧發(fā)生裝置

圖3 常氧及缺氧6h，各組GDF-15的表達情況

圖4 缺氧6 h時，各組CMEcs成管實驗結果

3 討 論

心肌梗死（Myocardial Infarction MI），是心肌缺血性壞死，是在冠狀動脈病變的基礎上，發(fā)生冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使相應的心肌嚴重而持久缺血導致心肌壞死。急性心肌梗死（AMI）可發(fā)生心律失常、休克或心力衰竭，屬急性冠脈綜合征的嚴重類型。如何有效地預防及治療冠心病，特別是急性心肌梗死，已成為目前心血管疾病研究的重要領域。在我們前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，GDF-15具有促進急性心肌梗死側枝循環(huán)形成的作用，本研究根據(jù)體內急性心肌梗死時的組織缺氧環(huán)境構建缺氧發(fā)生裝置，驗證GDF-15能否促進內皮細胞增殖及新生。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)：與缺氧6 h相比，當缺氧2 h時，各組均未出現(xiàn)較明顯的實驗結果；缺氧12 h時，約90%的細胞發(fā)生壞死；因此選擇缺氧6 h的時間點進行觀察與研究。

Western blot實驗表明：病毒轉染后，GDF-15過表達組實現(xiàn)了GDF-15高表達，GDF-15siRNA組實現(xiàn)了GDF-15低表達。缺氧條件下各組GDF-15較常氧組表達量增多，說明缺氧可能是GDF-15的一個刺激因素。

內皮細胞成管實驗表明：觀察缺氧6 h時各組在Matrigel Matrix的成管情況，過表達GDF-15組較空白對照組細胞形成管腔樣結構達90%以上，GDF-15siRNA轉染組未形成管腔樣結構。實驗證明，GDF-15可明顯促進內皮細胞成管，可能為改善缺血心肌的局部血液循環(huán)，促進血管新生以及側枝建立等起到關鍵作用。

綜上所述，GDF-15具有明顯促進內皮細胞增殖，并形成管腔的作用，從而進一步的闡明了GDF-15可以促進急性心肌梗死側枝循環(huán)的形成，為缺血性心臟病及急性心肌梗死疾病的預防及治療運用提供安全性必要保障。在下一步的研究中，我們將從細胞和動物模型水平兩方面對GDF-15是如何促進急性心肌梗死側枝循環(huán)的形成及其作用機制進行更深入的研究。

[1] 顧會平,吳明煜,郭曉紅.姜黃素對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其與Toll樣受體4／核因子 B信號通路的相關性[J].中國生物制品學雜志,2016,9(29):932-935.

[2] Andrew P, Patrick J,Bradford G,et al.Identification of a plasma metabolomic signature of thrombotic myocardial infarction that is distinct from non-thrombotic myocardial infarction and stable coronary artery disease[J].PLoS One,2017,12(4):91-98.

[3] Koushik R,Asma K,and Robert J H.Recent advances in the diagnosis and treatment of acute myocardial infarction [J].World J Cardiol,2015,7(5):243-276.

[4] 宋和鑒.生長分化因子15(GDF-15)對缺氧誘導的血管內皮細胞凋亡、血管新生的影響及機制的研究[M].2014,5:2-4.

Explore the effects of GDF - 15 on the myocardial microvascular endothelial cells into a tube under hypoxia

SHANG Xiao-sen1,WEI Bing-yan2,LIU Tian-fu2,CHEN Xiao-ping1＊
(1.Department of Cardiology, Taiyuan Central Hospital,Shanxi Taiyuan 030009,China;2.Laboratory Animal Center, experimental animal and human disease animal model Shanxi Key Laboratory, Shanxi Medical University,Shanxi Taiyuan 030001,China.)

Objective Through hypoxia generator make myocardial microvascular endothelial cells hypoxia, transfect GDF-15 virus, Observe its effects on CMECs into tube.Methods CMECs can be divided into five groups: blank control group, GDF-15siRNA group, control group of interfere, overexpression of GDF - 15 groups, control group of overexpression. Put the above groups into hypoxia generator ;By using Western-blotting to evaluate the expression of GDF-15 under the hypoxia condition. By endothelial cells into tube experiments，observe CMECs lumen structure formation of each group.Results Overexpression group than other group GDF- 15 protein expression significantly increased, interference group significantly decreased, and the expression of GDF-15 under hypoxia is higher than oxygen condition. CMECs of overexpression group lumen structure formated in hypoxia 6h, opposite to GDF-15siRNA and other control groups.Conclusion Hypoxia conditions can promote the expression of GDF–15 of CMECs,GDF-15 can promote the proliferation and formation of collateral circulation of CMECs.It laid a foundation for the research of GDF-15 on collateral circulation in acute myocardial infarction.

Acute myocardial infarction;Coronary collateral circulation;CMECs;GDF-15

】R363

B

ISSN.2095-6681.2017.31.56.03

山西省國際科技合作項目（2014081050-1）；山西醫(yī)科大學青年研究基金（02201430）

陳小平

吳宏艷