姜黃素治療幼年小鼠腦外傷的實驗研究

李 杰 李 珍 程 田

1) 開封市兒童醫院兒童重癥監護室，河南 開封 475000 2)開封市兒童醫院急診科，河南 開封 475000 3)鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

·論著科研之窗·

姜黃素治療幼年小鼠腦外傷的實驗研究

李 杰1)李 珍2)程 田3)△

1) 開封市兒童醫院兒童重癥監護室，河南 開封 475000 2)開封市兒童醫院急診科，河南 開封 475000 3)鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

目的探討幼年小鼠腦外傷后應用姜黃素(CCM)治療是否具有神經保護和促進神經再生的作用。方法將92只C57BL/6小鼠隨機分為3組，建立自由落體腦外傷動物模型，并分為假手術(Sham)組，腦外傷+生理鹽水(TBI+Vehicle)組，腦外傷+姜黃素(TBI+CCM)組。尼氏染色觀察大腦損傷體積，mNSS評分評價小鼠的運動功能，干濕稱重法檢測小鼠損傷側大腦水含量，Edu染色觀察SGZ區神經再生，Western blot 檢測β-catenin和GSK3β蛋白表達。結果幼年小鼠腦外傷后，CCM治療可減少大腦損傷體積，改善運動功能, 明顯增加Edu陽性細胞數，減少GSK3β的表達，同時增加β-catenin的表達(P<0.05)。結論幼年小鼠腦外傷后應用CCM治療能間接激活Notch通路，同時具有神經保護和促進神經再生的作用，為今后治療兒童腦外傷提供新的思路。

幼年小鼠；腦外傷；姜黃素；神經保護；神經再生

腦外傷(Traumatic brain injury，TBI)是由外力導致的大腦損傷。兒童腦外傷的發生率為2%～3%[1]，腦外傷后遺留的運動、認知和精神障礙仍會給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔和精神負擔，目前尚未發現行之有效的治療方法[2]。姜黃素(curcumin，CCM)是姜科姜黃屬植物根莖的主要成分，醫學研究表明，姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用。隨后發現其在神經系統疾病中也有較好的效果，如阿爾茨海默病、帕金森病和神經系統腫瘤等[3]，但關于姜黃素治療兒童腦外傷的研究未見報道。本實驗中，我們擬用新生21 d小鼠腦外傷模型模擬兒童腦外傷，mNSS評分評價小鼠運動功能[4]，同時應用EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)[5]染色觀察海馬體齒狀回顆粒下層(subgranular zone of the lateral ventricles，SGZ)神經再生情況，探討幼年小鼠腦外傷后運動，Notch通路表達及SGZ區神經再生情況，并觀察CCM在神經再生和神經保護中的作用。

1 材料與方法

設計：隨機對照動物實驗。時間及地點：實驗于2015-01—2016-01鄭州大學實驗中心完成。

1.1實驗動物和分組C57BL/6小鼠92只(3周)隨機分為3組：假手術(Sham)組，腦外傷+生理鹽水(TBI+Vehicle)組，腦外傷+(TBI+CCM)組。其中Sham組30只，TBI+Veh組31只，TBI+CCM組31只。

1.2動物模型的建立模型建立前，應用10%水合氯醛3 mL/kg進行麻醉，待麻醉成功后，備皮，酒精消毒，并將小鼠固定于腦立體定位儀上，采用改良式自由落體腦外傷動物模型[6]擊打小鼠。Sham組只開骨窗，不予打擊，縫合。打擊后3 h，TBI+CCM組小鼠給予腹腔注射CCM(2 mol/kg)，1次/d。TBI+Veh組給予同體積生理鹽水。進行EdU染色的小鼠，在腦外傷24 h后腹腔注射EdU(50 mmg/kg)，1次/d，第3次注射后4 h處死小鼠。

1.3運動功能評分腦外傷后應用mNSS(modifi-ed neurologic severity score)評分，評價小鼠運動功能[4]。mNSS評分標準是從小鼠運動、感覺、平衡能力及反射情況等方便進行評估。分別在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d給予mNSS評分檢測，采用雙盲法評判并記錄分值。

1.4腦水含量的測量腦外傷后3 d，小鼠麻醉后處死，快速取出損傷的左側半腦，稱取濕質量。隨后將腦組織放入烤箱，100 ℃，48 h后稱得干質量。根據公式得到大腦水含量，以判定大腦水腫程度。大腦腦水含量(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.5尼氏染色和大腦損傷體積計算按照尼氏染色步驟進行尼氏染色，在顯微鏡下獲得染色圖像，用Image J 軟件分析每個腦片大腦的缺損面積。缺損體積(mm3)=平均缺損面積× 0.025 ×10 × N。

1.6 EdU染色按EdU染色試劑盒(Thermofish-er)操作步驟進行染色，然后用4，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)染色顯示細胞核。在熒光顯微鏡下觀察實驗結果。

1.7 Western Blot檢測TBI后第3天，麻醉小鼠，灌注取損傷側腦組織，使用蛋白提取試劑盒提取損傷組織蛋白，NanoQ儀器測量蛋白濃度，加入溴化乙錠，金屬浴煮好備用。按照Western blot試劑盒說明書步驟進行實驗[7]，使用Image J軟件分析實驗結果。

2 結果

2.1 CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少損傷體積，改善運動功能，未明顯減少腦水含量TBI術后28 d，腦組織切片尼氏染色，計算大鼠大腦損傷體積(圖1A，10×)。結果顯示TBI+Veh組損傷體積為(10.91±0.87)mm3，高于TBI+CCM組的(7.94±1.05)mm3，2組差異有統計學意義(P<0.05，n=6/組)。腦外傷后14 ～28 d，經CCM治療后，小鼠的mNSS評分顯著降低(P<0.05，n=6/組，圖1B)。腦外傷3 d后，大腦水含量可以顯著增加。由TBI+Sham組的(76.06 ± 0.93)%增加到TBI+Veh組的(80.63±0.91)%(P<0.05)。經CCM治療，大腦水含量減至(79.52±1.06)%，和TBI+Veh組相比，未見明顯統計學差異(P>0.05，n=6/組，圖1C)。

圖1 TBI后CCM減少大腦損傷體積，改善運動功能，未明顯減少腦水含量

2.2 CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少GSK3β的表達，并增加β-catenin的表達腦外傷后，應用CCM治療3 d后，Western blot 結果顯示，TBI+CCM組中β-catenin表達高于Vehicle治療組，而GSK3β在CCM治療組中的表達量明顯少于Vehicle治療組(P<0.05，n=6/組，見圖2)。證實腦外傷后CCM治療可減少GSK3β表達，同時間接激活Wnt通路，增加β-catenin的表達。

圖2 CCM治療腦外傷，減少GSK3β表達，增加β-catenin表達，減少損傷周圍細胞壞死

2.3 CCM治療幼年小鼠腦外傷，增加海馬區神經再生用EdU染色標記海馬區增殖的神經干細胞，結果發現，腦外傷后3 d，TBI+CCM組小鼠海馬SGZ區的EdU陽性細胞數，明顯高于Vehicle治療組(P<0.05，n=6/組，見圖3)。

圖3 CCM治療腦外傷，增加SGZ區神經干細胞增殖

3 討論

兒童腦外傷是一種常見的兒童疾病，至今仍無一種有效的方法進行治療。近期發現，CCM具有神經保護作用，但至今尚無應用CCM治療兒童腦外傷的相關報道。我們應用幼年小鼠腦外傷模型模擬兒童腦外傷，并觀察腦外傷28 d后，小鼠成年后的運動功能改變，檢測CCM的療效，結果發現：(1)應用CCM治療幼年小鼠腦外傷，可減少小鼠大腦損傷體積，改善小鼠運動功能；(2)CCM治療可間接激活Notch通路，促進神經再生。研究表明Notch通路是神經再生中的重要通路，調節SGZ區和SVZ去神經干細胞的增殖和分化[8]。在此實驗中，姜黃素治療腦外傷可增加SGZ區神經干細胞的增殖，促進神經再生。同時，CMM有抗炎、抗氧化和清除自由基等廣泛藥理活性，有研究表明其對帕金森、癲癇等多種中樞神經系統疾病具有一定的神經保護作用[9]。通過此研究，我們發現姜黃素在治療幼年小鼠腦外傷中的神經保護和促進神經再生的重要作用，為今后TBI后促進神經再生，改善認知能力的臨床治療效果奠定基礎。而關于SGZ區神經干細胞的分化及成熟情況，我們將在以后做進一步的研究。

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TheroleofCCMontraumaticbraininjuryinyoungmice

LIJie*，LIZhen，CHENGTian

*DepartmentofPICU，Children'sHospitalofKaifengcity，Kaifeng475000，China

ObjectiveTo detect whether CCM could protect the brain after TBI.Methods92 C57BL/6 mice were divided into 3 groups randomly：Sham group，TBI+Vehicle (NaCl) group and TBI+CCM group.Construct the weight drop model which could mimic TBI.The lesion volume，motor and cognition function，the expression of β-catenin and GSK3β protein，the cell death near injury area and the neurogenesis in SGZ area were detected in each group.ResultsCCM treatment could decrease the volume of brain injury, improve motor function, significantly increase the number of Edu positive cells, reduce the expression of GSK3β, while increasing the expression of β-catenin (P<0.05).ConclusionIn the young mice TBI model，CCM decreased the lesion volume，promoted the motor and the cognition function，activated Notch pathway indirectivity，reduced the cell death near injury area，increased the neurogenesis in SGZ area and promoted a new method to treat TBI in young mice.

Young mice；Traumatic brain injury；CCM；Neuroprotection；Nerve regeneration

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.22.001

鄭州大學第一附屬醫院院內青年基金，項目編號：YNQN2017042

△通信作者：程田(1982—)，博士，主治醫師。研究方向：腦、脊髓神經損傷及修復。Email：chengtianzy@163.com

R-332

A

1673-5110(2017)22-0001-04

(收稿2017-05-11)

王喜梅