外源性膽紅素在缺血缺氧性腦損傷大鼠中的作用研究

侯立維 孔麗娜

1)鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014 2)鄭州大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450052

·論著科研之窗·

外源性膽紅素在缺血缺氧性腦損傷大鼠中的作用研究

侯立維 孔麗娜

1)鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014 2)鄭州大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450052

目的探討外源性膽紅素對缺血缺氧性腦損傷(HIBD)大鼠的影響及機制。方法以新生SD大鼠為研究對象，構建HIBD模型，探討5、10 和15 mg/kg膽紅素對大鼠學習記憶的影響，TUNEL檢測細胞凋亡程度，RT-PCR檢測腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平。結果與假手術組相比，模型組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，膽紅素處理各組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。與低劑量組與高劑量組相比，中劑量組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。造模后第 3、7、14 天，膽紅素處理各組大鼠神經細胞凋亡細胞數明顯少于模型組(P<0.05)；以中劑量組大鼠神經細胞凋亡細胞數最低。造模后第 3、7、14天，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，膽紅素處理各組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。與低劑量組和高劑量組相比，中劑量組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。結論適宜濃度的膽紅素可能通過降低腦組織VEGF、Caspase-3表達水平，阻止神經細胞死亡程序，發揮HIBD的神經保護作用。

缺血缺氧性腦損傷；膽紅素；VEGF；Caspase-3；大鼠；mRNA

新生兒圍生期窒息導致的缺血缺氧性腦損傷(HIBD)是一種危害較大的常見病，病死率和致殘率均較高。研究顯示，窒息兒中7.5%～57.6%可發生HIBD，嚴重者在新生兒早期死亡或遺留智力低下、腦癱、癲癇等神經系統后遺癥[1]。作為體內正常的代謝物，膽紅素具有雙重作用，適宜水平的血清膽紅素對機體具有保護作用，而血清膽紅素水平過高則對機體產生損傷，尤其是腦組織，可引起膽紅素腦病[2-3]。本研究通過建立HIBD大鼠模型，給予不同劑量的外源性膽紅素，觀察神經元的凋亡和腦損傷程度，旨在尋找外源性膽紅素干預HIBD的合適劑量，為腦損傷的早期干預提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級新生7 d SD大鼠75只，體質量12～16 g，購于河南省實驗動物中心，飼養于動物房，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組15只。

1.2主要試劑總RNA提取試劑盒(上海超研生物科技有限公司)，血管內皮生長因子(VEGF)、Caspase-3試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，TUNEL 測試試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，其他試劑均為分析純國產試劑。

1.3主要儀器超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)，精密電子天平(Adventurer 公司，美國)，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)，酶標儀(上海安亭科學儀器廠)。

1.4動物模型的構建采用經典Rice法制作 HIBD大鼠模型。大鼠置于超凈工作臺上，乙醚麻醉后分離并兩端結扎左側頸總動脈，回窩恢復 1 h 后，放入常壓缺氧箱中，常壓缺氧箱上端有2小孔，一孔與測氧儀相連接，另一孔按輸入氮氣、氧氣，控制氧氣濃度范圍在8%，常壓缺氧箱艙內溫度控制在(36 ±2)℃，持續缺氧3.5 h。假手術對照組不結扎動脈，不行缺氧處理。模型制作 4 h 后，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別腹腔注射5、10 和15 mg/kg膽紅素，假手術組、模型組給等量生理鹽水，1次/d，連續給藥5 d。

1.5標本采集造模后第 3、7、14天，隨機處死各組大鼠5只，處死前稱質量，麻醉后處死，斷頭取腦，保留腦脊液，分裝于凍存管中，液氮中快速冷凍于-80 ℃ 冰箱保存。

1.6檢測指標

1.6.1 水迷宮試驗：造模后第8 周進行Morris 水迷宮試驗檢測大鼠空間學習記憶能力，包括隱蔽平臺試驗和空間探索試驗，記錄大鼠的逃避潛伏期、原平臺象限停留時間及游泳速度。

1.6.2 TUNEL檢測細胞凋亡：腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，石蠟包埋，冰凍切片采用TUNEL進行細胞凋亡檢測，嚴格按TUNEL檢測試劑盒說明書操作。顯微鏡下紅色熒光為TUNEL陽性細胞，隨機選取6個不重復高倍視野(×200)，計算陽性細胞凋亡指數(AI)。計算公式為：AI=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.6.3 RT-PCR檢測VEGF、Caspase-3 mRNA水平：Trizol法分別提取各組大鼠總RNA。總RNA采用純化柱純化。引物設計：β-actin(239bp)上游引物：5'-AGGCATCCTGACCCTGAAGTA-3’，下游引物：5'-GAGGCATACAGGGACAACACAG-3′；VEGF(175bp)上游引物：5′-CGGACAGACAGACAGACACC-3′，下游引物：5’-CCCAGAAGTTGGACG-AAAAG-3′；Caspase-3(143bp)上游引物：5’-GGAGCAGTTTTGTGTGTGTGAT-3’，下游引物：5’-GAAGAGTTTCGGCTTTCCAGT-3’。逆轉錄為cDNA，應用RT-PCR檢測VEGF、Caspase-3和ACT-A mRNA轉錄水平。以β-actin作為內參照，同一標本的β-actin產物表達水平校正各自目的基因的表達水平，相對表達水平=目的基因表達水平/β-actin表達水平。

2 結果

2.1 Morris水迷宮試驗與假手術組相比，模型組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，膽紅素處理各組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。與低劑量組和高劑量組相比，中劑量組大鼠平均逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度均存在顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏、原平臺象限停留時間及游泳速度比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

2.2細胞凋亡造模后第 3、7、14 天，膽紅素處理各組大鼠神經細胞凋亡細胞數明顯少于模型組(P<0.05)；以中劑量組大鼠神經細胞凋亡細胞數最低。見圖1。

圖1 造模后3～14 d內各組大鼠神經細胞凋亡檢測結果

2.3 VEGF、Caspase-3 mRNA水平造模后第 3、7、14 天，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。與模型組相比，膽紅素處理各組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。與低劑量組和高劑量組相比，中劑量組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平均存在顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 造模后3～14 d內各組大鼠腦組織VEGF、Caspase-3 mRNA水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，▲P<0.05；與高劑量組比較，#P<0.05

3 討論

新生兒HIBD是導致新生兒后遺腦性癱瘓、癲癇和智能發育障礙的常見原因，近年來由于新生兒搶救成功率提高和高危妊娠增多，新生兒HIBD的發病率不斷上升[4]。但目前尚無特效治療藥物，尋找有效的HIBD治療藥物一直是該領域的研究熱點[5]。

作為一種彌漫性損傷，HIBD發病機制十分復雜，涉及多種機制的綜合作用過程，而與感覺運動功能和學習記憶等密切相關的海馬和皮層等腦的重要區域在此過程中可能受損，從而導致感覺運動功能受損，空間記憶和學習能力下降[6-7]。本研究表明，缺血缺氧可導致大鼠空間學習記憶障礙，細胞凋亡檢測結果提示大腦皮質神經元凋亡加快。歐陽福連等[8]報道，HIBD可導致大鼠超微結構損傷和遠期神經元減少，導致遠期行為學功能障礙。林莉等[9]報道，HIBD幼鼠海馬齒狀回神經元受到損傷，神經細胞微環境發生改變，處于不增殖狀態的內源性神經干細胞可在一定程度上被激活，具備分化成為新神經元的潛質，但其啟動自發修復作用有限。

膽紅素是人膽汁中的主要色素，是鐵卟啉化合物的主要代謝產物。膽紅素具有一個延伸的共軛雙鍵系統，生理濃度的膽紅素既是超氧自由基的清除劑，又是內源性抗氧化劑[10-11]。1987年膽紅素首次被證實具有保護細胞免受活性氧損傷的作用。但當膽紅素血清濃度過高則對機體產生損傷，尤其是腦組織，可引起膽紅素腦病[12]。本研究顯示，造模后第 3、7、14 天，膽紅素處理各組大鼠神經細胞凋亡細胞數明顯少于模型組(P<0.05)；以中劑量組大鼠神經細胞凋亡細胞數最低，表明中低劑量的膽紅素對HIBD大鼠有保護作用，可促進感覺運動功能和空間記憶功能的恢復，而高劑量則有毒性作用。高濃度膽紅素可影響新生兒代謝、免疫等過程，目前其確切的機制尚不十分清楚，可能與促進細胞凋亡和該過程中的大量細胞因子生成有關[13]。

細胞凋亡是一個十分復雜的過程，多種基因參與凋亡的發生。VEGF是一類促進血管再生的細胞因子，可增加血管通透性，誘導其表達的主要因素是缺血或低氧[14]。Caspase是半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的簡稱，與細胞凋亡過程密切相關，是多條凋亡通路的交叉點。研究發現，高膽紅素血癥腦損傷后檢測腦組織中Caspase-3的表達水平變化，可為腦損傷時間、程度的評估提供依據[15]。本研究證實，中低劑量的膽紅素可能通過降低腦組織VEGF、Caspase-3表達水平，阻止神經細胞死亡程序發揮HIBD的神經保護作用。

綜上所述，適宜濃度的膽紅素可能通過降低腦組織VEGF、Caspase-3表達水平，阻止神經細胞死亡程序發揮HIBD的神經保護作用。

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Effectofexogenousbilirubinonhypoxic-ischemicbraindamageinratsanditsmechanism

HOULiwei*，KONGLina

*TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

ObjectiveTo investigate the effect of exogenous bilirubin on hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) rats and its mechanism.MethodsThe effects of 5，10 and 15 mg/ kg bilirubin on learning and memory in rats were studied by using HIBD model.TUNEL was used to detect the degree of apoptosis.RT-PCR was used to detect the expression of VEGF and Caspase- 3 mRNA levels.ResultsCompared with the sham operation group，the mean escape latency，the quadrant residence time and the swimming speed in the model group were significantly different (P<0.05).Compared with the model group，the mean escape latency of the rats treated with bilirubin was significantly different (P<0.05).Compared with the low dose group and the high dose group，the the mean escape latency，the quadrant residence time and the swimming speed in the middle dose group were significantly different (P<0.05).The number of apoptotic cells in the neurons of the rats treated with bilirubin was significantly lower than that of the model group at the 3rd，7th and 14th day after model establishment (P<0.05).The number of apoptotic cells in the neurons of the middle dose group was the lowest.There were significant differences in VEGF and Caspase-3 mRNA levels in the model group compared with the sham operation group at the 3rd，7th and 14th day after modeling (P<0.05).Compared with the model group，the levels of VEGF and Caspase-3 mRNA in the brain tissue of the rats treated with bilirubin were significantly different (P<0.05).Compared with the low dose group and the high dose group，the levels of VEGF and Caspase-3 mRNA in the brain tissue of the middle dose group were significantly different (P<0.05).ConclusionThe appropriate concentration of bilirubin may play a neuroprotective effect in HIBD by reducing the expression of VEGF and Caspase-3 in brain tissue and preventing neuronal death.

Hypoxic-ischemic brain injury；Bilirubin；VEGF；Caspase-3；Rats；mRNA

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.22.002

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目，編號：142300410065

侯立維(1973-)，男，漢族，碩士，副主任醫師。研究方向：神經內科學。Email：houliwei@yeah.net

R-332

A

1673-5110(2017)22-0005-04

(收稿2017-09-26)

張喜民