自噬調控機制對多發性硬化的影響

張新燕 原鉑堯 趙 金 高曉紅 孫靜潔 王滿俠

蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000

·綜述·

自噬調控機制對多發性硬化的影響

張新燕 原鉑堯 趙 金 高曉紅 孫靜潔 王滿俠△

蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經系統(central nervous system，CNS)自身免疫性脫髓鞘疾病，是導致年輕人致殘的最主要的CNS疾病，發病機制尚不明確。自噬(autophagy)是細胞降解和回收利用細胞內生物大分子與細胞器的過程，是細胞重要的自穩機制，已經發現其在神經退行性疾病細胞代謝中有重要作用，如阿爾茲海默病，同時，自噬也參與進自身免疫的調節，也許對于MS的疾病病理過程有重要作用。

多發性硬化；自噬；EBV；瓜氨酸化；中樞神經系統

1 自噬

自噬(autophagy)也被稱為 “ 自我吞噬 ”，是一種進化上高度保守的溶酶體降解途徑，通過形成自噬體實細胞內生物大分子與受損細胞器的“自清”，保護重要的細胞骨架、線粒體等，實現細胞質成分更新、再循環[1]。

我們將最初在S型啤酒酵母菌中發現的參與自噬過程的一些基因命名為自噬相關基因(aytophagy-relative gene，Atg)，他們主要通過兩個泛素化的結合系統：Atg12-Atg5和Atg8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)調解自噬體形成[2-3]，在哺乳動物中，主要有Beclin1、Atg5、LC3和Atg12等[4]。

自噬體是細胞自噬代謝的主要形式，起源自吞噬體兩端，其形成包括起始-延長-成熟-融合四個階段[5]。一種富含PI3P(phosphatidylinositol 3-phosphate，3-磷脂酰肌醇)的膜碎片組成前PI3P膜體(omegasome)，LC3(microtubule-associated protein1 light chain 3，微管相關蛋白1輕鏈3)分布于Omegasome內外，介導其募集吞噬物質及形成閉合的雙層膜結構囊泡——自噬體(autophagosome)，在自噬體形成后LC3自動脫落[6]；自噬體與吞噬體分離后，沿細胞骨架活動至溶酶體并與之融合，形成單層膜包裹需降解物的囊泡——自噬溶酶體(autophagolysosome)；最后其中的變性蛋白質衰老細胞器被細胞溶酶降解并為ATP的生產、大分子的合成等提供基質[1]。

根據物質轉運方式、激發途徑、調節因子不同，可將哺乳動物自噬分為三類：微自噬(mitophagy)、巨自噬(macrophagy)和伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)，一般的自噬即巨自噬(macrophagy)[4]。調節自噬體形成的關鍵機制可分為以下五組：unc 51-like kinase complex(ULK復合體)、the class Ⅲ phosphatidylinositide 3-kinase complex(PI3K復合體)、the Atg2/WD repeat domain phoshhoinositide-interacting protein complex and the Atg9cycling system(WIPI復合體與Atg9循環系統)、the Atg12-conjugation system(Atg12共軛系統)、the microtubule-associated protein1 light chain 3-conjugation system(LC-3共軛系統)[7]，調節自噬體自噬體從形成到與溶酶體溶解的各個環節。

2 自噬與多發性硬化相關的免疫調節

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種世界性分布的中樞神經系統(central nervous system，CNS)白質脫髓鞘疾病，是遺傳易感個體與環境因素共同作用導致的自身免疫性疾病，神經退行性變與炎性脫髓鞘是其主要的病理特征。在MS實驗室研究中，目前公認小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為理想的動物模型，建模原理是致敏抗原如髓鞘堿性蛋白(MBP)或其多肽片段(如MBP peptide 89—101)、少突膠質細胞糖蛋白(MOG)等與佐劑共同激活CD4+T細胞，誘發對自身髓鞘抗原的免疫應答，導致局部炎癥細胞浸潤及髓鞘脫失。

2.1自噬與免疫細胞MS是炎性細胞透過被破壞的血腦屏障(blood-brain barrier)與CNS常駐的免疫細胞共同引起的髓鞘損傷和神經元丟失，自噬機制在此過程中可能扮演者調節者的角色。

自噬參與細胞凋亡同時也參與細胞存活，這在免疫細胞中也有體現。Atg5缺失的CD4+T和CD8+T可以正常地在胸腺里發育，但是因為大量死亡和不能有效再分化，T細胞受體激活時難以在周圍免疫系統中再分布[8]；Beclin1敲除的T細胞在第二級淋巴結中明顯減少等[6]，這些實驗提示，自噬可能在自身免疫激活后的免疫細胞成熟、分化中扮演著一定的角色。在EAE相關實驗也證明了這個推論：敲除Beclin1的小鼠甚至不能被誘導出現MS相似病灶[9]；周圍免疫系統T細胞來源的RNA分析顯示Atg5表達的蛋白在SPMS(secondary-progressive MS)患者的腦組織中明顯升高[10]；Atg5、Atg7缺失的CD8+T細胞不能形成有效的免疫記憶等；同樣，在B細胞中也是，Atg5缺失的B細胞因為凋亡增加而不能有效分化[11]。也有不同的聲音，另一項研究顯示Beclin1雖然在淋巴細胞祖細胞亞群的存活中有一定作用，但是在周圍免疫系統的T/B細胞的穩態和功能中并不是那么重要，其他基因靶向敲除后也可以得到同樣的結果[6]。雖然這些結果都顯示自噬機制在免疫細胞分化與增殖過程中有一定作用，但是具體的作用機制還尚未明確。

2.2自噬與抗原提呈抗原提呈是MS/EAE發病關鍵的先決條件，分泌的細胞因子活化致腦炎T細胞，誘導疾病發生。自噬是一種新發現的CD4+T細胞識別的內源性抗原MHC Ⅱ類抗原提呈途徑，在一些專職APCs，如B細胞、DCs中，當受到生殖細胞編碼的模式識別受體(germline-encoded pattern-recognition receptors)如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)、炎癥因子刺激時，自噬體可以與MIICs融合而試驗性提呈抗原，抗原特異性CD4+T細胞通過與自噬體膜表面的LC3結合而對提呈抗原粗識別[12]。

另外，MS早期的損傷與CNS氧化應激相關，最明顯的就是NOX2(NADPH oxidase complex 2，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶復合體2)的表達，可以在超過20%的髓鞘細胞中檢測到，并且主要位于受損區域的邊緣[13]，促進CNS炎癥發生。一般情況下，NOX2以過度糖基化的形式表達于細胞內的次級顆粒，少量存在于內質網，當受到某種刺激時，他的亞族形成活化的NOX2復合體轉移至形成過程中的吞噬體膜表面表達，釋放產生ROS，協助蛋白酶降解吞噬體內的抗原[14]。在專職APCs中，其功能主要為抗原提呈而發起免疫應答而不是抗原殺滅或者細胞碎片降解，NOX2因為可以改變吞噬體內的pH值而調控抗原降解，從而影響抗原提呈，如DCs缺乏NOX2時表現為PH降低、抗原降解增加、抗原交叉提呈減少[14]。所以可以推測，NOX2也許是非經典的自噬途徑基本組成部分，不僅影響吞噬體內的抗原代謝，同時調整抗原在MHC II類分子上的裝配，從而影響CD4+T細胞相關的CNS炎性疾病。

3 自噬與MS相關抗原代謝

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin/oligodendrocyte glycoprotein (MOG)是MS發生、發展的重要抗原之一，可作為抗原制作EAE模型，MOG35-55多肽片段通過激活CD4+Th1細胞引發CNS炎性改變。實驗發現EBV感染的B細胞對MOG抗原分子有保護作用，這種保護作用可能是通過自噬實現的。

在自噬體形成的過程中，細胞質內的Atg8/LC3(Microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3，微管結合蛋白1A/1B-輕鏈3)可通過與PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)結合而插入其膜結構；在與溶酶體結合前，自噬體也會與一些內體融合，內體中含有待降解的蛋白、內吞作用后形成的受體-配體復合物等，形成的融合物被稱作自噬內涵體(amphisome)。鈣離子是自噬體形成、成熟過程中重要的因素之一[15]，可沉積在自噬體、自噬內涵體中，形成高Ca2+環境[16]。瓜氨酸化(citrulliantion)是一種可在正常代謝中觀察到的轉錄后修飾(post-translational modification，PTM)，簡單的講，瓜氨酸化就是將蛋白質殘基末端的精氨酸在PAD(peptidyl arginine deininase，肽酰基精氨酸脫亞胺酶)作用下轉化為瓜氨酸[17](見圖1)。PAD 的活性與高于正常水平的 Ca2+濃度相關，自噬體、自噬內涵體中的高Ca2+活化PADs而促進其中的蛋白分子高瓜氨酸化[17]，導致抗原代謝異常，這其中就包括MOG。

圖1 瓜氨酸化

B細胞可以在抗原滴度很低的情況下通過其受體捕獲抗原，外源性蛋白質自身抗原的加工需要核內體和部分內溶酶體的蛋白酶參與，含有被捕獲抗原的內體與含有蛋白水解酶的溶酶體融合，如組織蛋白酶G(cathepsin，CatG)[18]，將抗原降解成適宜長度的多肽，后被裝配到MHC-Ⅱ類分子上，表達于CD4+T細胞表面并被提呈。抗原分子被EBV感染后的B細胞捕獲后被內吞形成內體，MOG35-51中含有一個可以與自噬體表面錨定位受體LC3-Ⅱ結合的序列——LC3-interacting region (LIR) motif ([W/F/Y]xx[L/I/V][19])相互重疊的片段F44xxV47(F-LIR)，其酸性殘基(E，D，S)與側鏈芳香基F共同形成了與LC3上疏水口袋(hydrophobis pocket，HP1)的結合力。MOG40-48多肽中的Arg41/Arg46為CatG降解的切割位點，自噬體中的高Ca2+環境活化PADs誘導其中的精氨酸(Arg41/Arg46)瓜氨酸化而不能被CatG有效降解[20]，這樣通過自噬體存活的抗原被呈遞給HLA-E并激活具有自身免疫活性的CD8+CD56+T 細胞，在抗原是別的過程中，MS易感基因HLA-DRB1*15：01和HLA-DRB5*01：01在關鍵的HLA結合殘基對瓜氨酸化抗原表位提呈也表現出優先性[17](見圖2)。實驗同時證明，當用雷帕霉素增加自噬體形成時，MOG35-55的保護也增加，用3-MA抑制自噬，其降解增強。

圖2 MOG35-55

4 自噬相關的MS治療

自噬治療MS尚處于實驗室研究階段，藥物主要是雷帕霉素。雷帕霉素是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin或mechanistic target of rapamycin，mTOR)信號系統最為經典的抑制誘導劑，可選擇性地結合免疫親和蛋白FKBP12(FK560-binding protein of 12 kD，12 KD FK560結合蛋白)，依附于mTOR的C端，抑制mTORC1與Agt1結合，抑制mTORC1信號傳導，上調自噬活性[21]，且能穩定的通過血腦屏障，已作為腎移植后免疫抑制劑在臨床上使用。Marianna等[22]人實驗發現，PLP139—151(proteolipid protein，髓鞘蛋白脂蛋白139—151)多肽誘導雌性SJL/j小鼠建立的模型中，從免疫后10 d開始用雷帕霉素1 mg/kg治療小鼠，口服和腹腔注射均可有效降低臨床癥狀出現頻率(-40%)和嚴重程度，同時減少復發；李振峰等[23]的實驗發現，雷帕霉素結合其他免疫抑制劑可以放大療效；Lisi等[24]也發現，第二次注射MOG使小鼠癥狀進展時，雷帕霉素在神經痛方面有更為突出的效果。

但也有研究表明，雷帕霉素并不是我們所想的那樣“有效”，mTOR長期激活會使神經元分化過早和成熟障礙等，可能與之調節膠質細胞髓鞘形成過程中的發現有關。在發育的小鼠腦內發現了強烈的mTOR活動，通過不同的途徑參與到少突膠質細胞發育的過程中，雷帕霉素減少了髓鞘形成相關蛋白的mRNA的轉錄[25]，進一步試驗甚至發現，在3周齡的小鼠即使髓鞘相關的mRNA水平不變，雷帕霉素也可直接減少髓鞘蛋白翻譯。故mTOR在髓鞘形成過程中的作用和其在CNS炎性調節的功能出現沖突，同時自噬作用對于MOG抗原的保護的研究也是雷帕霉素用于治療MS的反對聲音。

5 總結與展望

自噬作為機體的一種基本調節方式，有著復雜多向的作用機制和效果，我們對它的了解可能只是冰山一角。通過調節自噬治療MS，可以利用它清除堆積的變性蛋白，維持免疫趨于有利于疾病愈合的方向，同時也要避免過度激發自噬導致細胞凋亡或影響髓鞘再生。不僅要著眼于自噬與疾病治療的研究，也許自噬與維持血腦屏障完整性、調節髓鞘發生、介導中樞神經系統退行性疾病發生都有關聯。但是現有的研究還沒有系統的臨床試驗指導具體治療，但是可以肯定的是，自噬作為強有力的調節方式，在今后CNS的疾病治療研究中將有重要的價值。

[1] Xie Z，Klionsky DJ.Autophagosome formation：core machinery and adaptations[J].Nat Cell Biol，2007，9(10)：1 102-1 209.

[2] Ohsumi Y.Molecular dissection of autophagy：two ubiquitin-like systems[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2(3)：211-216.

[3] Suzuki K，Ohsumi Y.Molecular machinery of autophagosome formation in yeast，Saccharomyces cerevisiae[J].FEBS Lett，2007，581(11)：2 156-2 161.

[4] Cecconi F，Levine B.The role of autophagy in mamm-alian development：cell makeover rather than cell death[J].Dev Cell，2008，15(3)：344-357.

[5] Burman C，Ktistakis NT.Autophagosome formation in mammalian cells.Semin Immunopathol[J].2010，32(4)：397-413.

[6] Keller CW，Lünemann JD.Autophagy and Autophagy-Related Proteins in CNS Autoimmunity[J].Front Immunol，2017，8：165.

[7] Feng Y，He D，Yao Z.The machinery of macroautopha-gy[J].Cell Res，2014，24(1)：24-41.

[8] Pua HH，Dzhagalov I，Chuck M.A critical role for the autophagy gene Atg5 in T cell survival and proliferation[J].J Exp Med，2007，204(1)：25-31.

[9] Kovacs JR，Li C，Yang Q.Autophagy promotes T-cell survival through degradation of proteins of the cell death machinery[J].Cell Death Differ，2012，19(1)：144-152.

[10] Alirezaei M，Fox HS.Elevated ATG5 expression in autoimmune demyelination and multiple sclerosis[J].Autophagy，2009，5(2)：152-158.

[11] Miller BC，Zhao Z，Stephenson LM，et al.The autop-hagy gene ATG5 plays an essential role in B lymphocyte development[J].Autophagy，2008，4(3)：309-314.

[12] Nimmerjahn F，Milosevic S.Major histocompatibility complex class II-restricted presentation of a cytosolic antigen by autophagy[J].Eur J Immunol，2003，33(5)：1 250-1 259.

[13] Stys PK，Zamponi GW.Will the real multiple sclerosis please stand up[J].Nat Rev Neurosci，2012，13(7)：507-514.

[14] Savina A，Jancic C.NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells[J].Cell，2006，126(1)：205-218.

[15] Fader CM，Colombo MI.Autophagy and multivesicular bodies：two closely related partners[J].Cell Death Differ，2009，16(1)：70-78.

[16] Münz C.Enhancing immunity through autophagy[J].Annu Rev Immunol，2009，27：423-449.

[17] Nguyen H，James EA.Immune recognition of citrullinated epitopes[J].Immunology，2016，149(2)：131-138.

[18] Blum JS，Wearsch PA，Cresswell P.Pathways of antigen processing[J].Annu Rev Immunol，2013，31：443-473.

[19] BirgisdottirB，Lamark T，Johansen T.The LIR motif-crucial for selective autophagy[J].J Cell Sci，2013，126(Pt 15)：3 237-3 247.

[20] 'tHart BA，Kap YS，Morandi E.EBV Infection and Multiple Sclerosis：Lessons from a Marmoset Model[J].Trends Mol Med，2016，22(12)：1 012-1 024.

[21] Hartford CM，Ratain MJ.Rapamycin：something old，something new，sometimes borrowed and now renewed[J].Clin Pharmacol Ther，2007，82(4)：381-388.

[22] Esposito M，Ruffini F.Rapamycin inhibits relaps-ing experimental autoimmune encephalomyelitis by both effector and regulatory T cells modulation[J].J Neuroimmunol，2010，220(1/2)：52-63.

[23] Li Z，Chen L，Niu X，et al.Immunomodulatory synergy by combining atorvastatin and rapamycin in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)[J].J Neuroimmunol，2012，250(1/2)：9-17.

[24] Lisi L，Navarra P，Cirocchi R，et al.Rapamycin reduces clinical signs and neuropathic pain in a chronic model of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuroimmunol，2012，243(1/2)：43-51.

[25] Dello RC，Lisi L，Feinstein DL.mTOR kinase，a key player in the regulation of glial functions：relevance for the therapy of multiple sclerosis[J].Glia，2013，61(3)：301-311.

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.22.030

甘肅省國際科技合作專項(編號：1604WKCA015)

△通信作者：王滿俠，本科，教授，博士生導師，主任醫師。研究方向：神經感染與免疫。Email：wmx322@aliyun.com

R744.5+1

A

1673-5110(2017)22-0108-04

(收稿2017-05-20)

王喜梅