侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測

謝麗雪，張小艷，鄭姍，張立杰，李韜

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侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測

謝麗雪，張小艷，鄭姍，張立杰，李韜

（福建省農業科學院果樹研究所，福州 350013）

鑒定福建果園西番蓮上的夜來香花葉病毒（，TeMV），并建立用于該病毒特異性檢測的分子快速檢測方法，為該病毒的防治提供參考依據。采用血清學檢測、電鏡觀察、通用簡并引物RT-PCR、特異性引物RT-PCR對福建西番蓮樣品進行病毒檢測，并對陽性樣品的PCR產物進行克隆、測序；根據已報道的夜來香花葉病毒基因序列和本研究的序列測定結果，設計一對用于擴增TeMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因全長的特異性引物，通過反應條件優化，建立該病毒的特異性RT-PCR檢測方法；序列測定結果利用BLAST程序和DNAMAN軟件進行比對，同時對獲得的CP基因序列采用MrBayes軟件的貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構建系統發育樹并進行系統發育分析。血清學檢測發現，一株表現有花葉、皺縮癥狀的西番蓮樣品與馬鈴薯Y病毒屬（）通用抗體反應呈陽性；電鏡觀察結果表明，該株疑似帶毒樣品中含有大小約750 nm×12 nm的彎曲線狀病毒粒子；通用簡并引物RT-PCR從該樣品中擴增到一條與預期大小相符的目的片段，克隆、測序獲得長度為680 bp的序列，該序列與已報道的TeMV核苷酸序列一致性最高（98.2%）。特異性引物擴增獲得的CP基因序列全長為816 bp（命名為BXGFJ-13分離物），與已報道的TeMV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分別為86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系統發育分析結果表明，13個TeMV分離物共形成3個類群，相同地區或寄主來源的分離物優先相聚成簇，表現出很強的地理和寄主特異性。本研究獲得的BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）先以較高的后驗概率聚為一個分支，再與泰國2個分離物（AM409188、AM409187）聚為第2類群（Group II），表明其在系統發育關系上與中國廣西分離物的親緣關系最近。利用特異性引物TeMV-CPf/TeMV-CPr建立的RT-PCR方法，具有良好的特異性，僅能從感染TeMV的西番蓮樣品上擴增出目的片段，而從黃瓜花葉病毒（，CMV）、甜菜花葉病毒（，BtMV）、大豆花葉病毒（，SMV）、虎眼萬年青花葉病毒（，OrMV）、洋蔥黃矮病毒（，OYDV）、東亞西番蓮病毒（，EAPV）等其他病毒樣品及陰性對照上均未擴增出目的片段。靈敏度測定結果顯示，該方法能從稀釋102倍的RNA上擴增出目的片段。根據國際病毒分類委員會（ICTV）關于病毒不同成員的分類標準，同時結合血清學檢測、電鏡觀察結果，證實福建果園表現花葉、皺縮癥狀的西番蓮上攜帶有TeMV；建立的特異性RT-PCR方法能夠用于TeMV的快速檢測。

西番蓮；夜來香花葉病毒；分子鑒定；檢測

0 引言

【研究意義】西番蓮（）是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（）多年生草質藤本植物，原產南美的巴西、阿根廷，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區，在中國主要分布于臺灣、廣東、福建、廣西、浙江、四川等地區。西番蓮營養價值高、風味獨特，果實含有130多種芳香類物質，幾乎涵蓋了熱帶、亞熱帶大部分水果的香型，因此又稱百香果[1-4]。西番蓮作為一種高級天然飲料作物，在栽培生產過程中，常常受到病蟲害的危害，其中病毒病是西番蓮生產上的第2大病害，嚴重影響其產量和品質，在很多地區已成為限制西番蓮生產發展的重要因素[5-7]。近年來，隨著國內消費者對西番蓮需求的不斷增長，中國西番蓮的種植面積逐漸增大，病毒病隨之發生、傳播和擴散的風險也越來越高。為預防與控制西番蓮病毒病，加強病毒的早期檢測，明確病毒發生的種類，對于及時制定有效的防治措施，保護西番蓮生產安全具有重要意義。【前人研究進展】目前，國內外報道能夠侵染西番蓮的病毒主要包括馬鈴薯Y病毒科（）馬鈴薯Y病毒屬（）的西番蓮木質化病毒（，PWV）[8-9]、豇豆蚜傳花葉病毒（，CABMV）[10-12]、東亞西番蓮病毒（，EAPV）[13-14]、西番蓮果環斑病毒（，PFRSV）[15]、西番蓮Y病毒（，PaVY）[16-17]、西番蓮斑駁病毒（，PaMV）[18]、大豆花葉病毒（，SMV）[19]、馬來西亞西番蓮病毒（，MPV）[20]、夜來香花葉病毒（，TeMV）[21]，雀麥花葉病毒科（）黃瓜花葉病毒屬（）的黃瓜花葉病毒（，CMV）[22-23]，雙生病毒科（）菜豆金黃花葉病毒屬（）的大戟曲葉病毒（，ELCV）、廣東番木瓜曲葉病毒（，PaLCuGdV）、西番蓮扭葉病毒（，PLDV）[24-25]，蕪菁黃花葉病毒科（）蕪菁黃花葉病毒屬（）的西番蓮黃花葉病毒（，PFYMV）[26]，柑橘粗糙病毒屬（）的西番蓮綠斑病毒（，PFGSV）[27]，乙型線狀病毒科（）香石竹潛隱病毒屬（）的西番蓮潛隱病毒（，PLV）[28]，帚狀病毒科（）煙草花葉病毒屬（）的西番蓮花葉病毒（，MrMV）[29]和豇豆花葉病毒科（）線蟲傳多面體病毒屬（）的番茄環斑病毒（，ToRSV）等[30]。其中，夜來香花葉病毒（TeMV）是近年來西番蓮上新報道的一種病毒，基因組具有典型的結構特征，正義ssRNA，全長9 689 nts，編碼一個長的聚合蛋白。TeMV的病毒粒體呈線狀，長約750 nm，寬約12 nm。TeMV侵染寄主植物主要引起花葉癥狀，在越南夜來香、泰國西番蓮、印度尼西亞廣霍香上已有發生危害的報道，該病毒可通過機械接種傳播，但是否通過蚜蟲傳播尚未明確。由于西番蓮在生產上常采用扦插、嫁接育苗，因此TeMV可能通過上述途徑大面積或遠距離傳播。鑒別寄主鑒定、電鏡觀察、血清學檢測、RT-PCR是植物病毒檢測診斷的常用方法。Chiemsombat等[21]通過電鏡觀察提純的病毒粒體形態、血清學和RT-PCR方法，檢測了泰國西番蓮上的TeMV，同時研制了用于該病毒快速檢測的免疫膠體金診斷試紙條，最低可檢測到稀釋640倍的感病西番蓮汁液；Ha等[31]在圓柱狀內含體蛋白（cylindrical protein，CI）和輔助成分-蛋白酶（helper component- proteinase，HC-Pro）編碼區域設計2對新的簡并引物，從越南夜來香上檢測出TeMV，并測定了其全基因組序列。【本研究切入點】關于TeMV，國內種植的西番蓮上尚未有該病毒發生的正式文獻研究報道，僅GenBank上有中國廣西分離物部分基因序列的記錄（KJ789129）。福建西番蓮種植園內疑似帶毒樣品上是否攜帶有TeMV有待進一步明確。【擬解決的關鍵問題】采用血清學、電鏡觀察和分子生物學相結合的方法對引起福建西番蓮花葉、皺縮癥狀的病原進行鑒定，明確其具體種類，并建立該病毒的特異性分子快速檢測方法，為該病毒的檢測及防控提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2017年在福建省農業科學院果樹研究所完成。

1.1 材料

供試西番蓮樣品采自福建西番蓮種植園，共56份，保存于-80℃冰箱。供試毒源CMV、BtMV、SMV、OrMV、OYDV、EAPV等由筆者實驗室保存。通用抗體檢測試劑盒購自Agdia公司；M-MuLV反轉錄酶、RNasin購自Promega公司；DNA聚合酶、pMD-18T載體購自TaKaRa公司；DNA Marker、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。裂解介質管購自美國MP Biomedicals公司。

1.2 血清學檢測

采用Indirect-ELISA方法，具體參照試劑盒說明書。試驗設置陽性對照、陰性對照和空白對照，3個重復。利用Infinite M200多功能酶標儀測定405 nm下的OD值，樣品OD405 nm/陰性對照OD405 nm＞2時，判定檢測結果為陽性。

1.3 電鏡觀察

采用2%磷鎢酸負染色，西番蓮樣品提取液吸附于銅網支持膜后置于H-7650透射電鏡下觀察病毒粒體形態。

1.4 總RNA提取

稱取0.1 g西番蓮葉片樣品放入2 mL裂解介質管中，加入1 mL TrizoL試劑，在MP FastPrep?-24研磨機上研磨后靜置5 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，取上清；加入氯仿300 μL，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置15 min，4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用1 mL 75%冷乙醇洗滌后4℃下7 500 r/min離心3 min，棄上清；RNA沉淀干燥后，用30 μL經DEPC（焦碳酸二乙酯）處理過的ddH2O溶解，-80℃保存。

1.5 引物設計與合成

通用簡并引物為正向引物LegpotyF：5′-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3′，反向引物LegpotyR：5′-AYYTGYTYMTCHCCATCCATC-3′[32]；特異性引物根據已報道的TeMV外殼蛋白基因序列設計，正向引物TeMV-CPf：5′-TCAAGTAAGGTGGATG ATGTT-3′，反向引物TeMV-CPr：5′-CTGCACAGAGC CAACCCCAA-3′，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.6 RT-PCR

以提取的西番蓮葉片總RNA為模板（3 μL），加入隨機引物（10 μmol·L-1）1 μL、ddH2O 7 μL，72℃水浴10 min后迅速冰浴，再依次加入M-MuLV反轉錄酶緩沖液（5×）5 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL、RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉錄酶（200 U·μL-1）1 μL，42℃1 h、72℃10 min合成cDNA。通用簡并引物PCR反應體系（25 μL）：2×PCR mix 12.5 μL，LegpotyF（10 μmol·L-1）1 μL，LegpotyR（10 μmol·L-1）1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL；PCR擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s、45℃退火45 s、72℃延伸1 min，35個循環后72℃延伸10 min。特異性引物PCR反應體系（25 μL）：PCR Buffer（10×）2.5 μL、MgCl2（25 mmol·L-1）2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、TeMV-CPf（10 μmol·L-1）1 μL、TeMV-CPr（10 μmol·L-1）1 μL，DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μl，ddH2O 13.8 μL，cDNA 2 μL；PCR擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環后72℃延伸10 min。PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠（含GelRed染料）電泳，凝膠成像系統觀察電泳結果。

1.7 PCR產物克隆測序及序列分析

PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收目的片段，連接于pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5，然后涂布含氨芐青霉素的LB固體培養基上，篩選陽性克隆，送上海生物工程技術服務有限公司進行測序。序列比對采用BLAST和DNAMAN軟件。

系統發育樹構建采用MrBayes 3.26軟件[33]貝葉斯法（Bayesian inference，BI），通過ModelFinder[34]計算獲得最佳核苷酸替換模型為HKY+G4，并參照BIC標準設置相關參數，共運行200萬代，每隔100代抽樣1次，舍棄25%老化樣本后，根據剩余的樣本樹獲得50%多數原則一致樹（50% majority-rule consensus tree），樹各節點的置信度通過計算的后驗概率（posterior probability，PP）進行評估。在重建BI樹過程中，以大豆花葉病毒分離物（FJ548849）為外群（outgroup）。

1.8 特異性引物RT-PCR的特異性、靈敏度測定

分別以CMV、BtMV、SMV、OrMV和EAPV毒源及感染TeMV的西番蓮葉片為樣品，同時以健康西番蓮葉片為陰性對照，利用引物對TeMV-CPf/ TeMV-CPr進行RT-PCR，測定特異性。將從感染TeMV的西番蓮葉片中提取的總RNA，用健康西番蓮葉片提取的總RNA作10倍梯度稀釋，以引物對TeMV-CPf/TeMV-CPr進行RT-PCR，測定靈敏度。

2 結果

2.1 ELISA檢測

采用Indirect-ELISA對疑似帶毒西番蓮樣品進行病毒檢測，結果發現，一株表現有花葉、皺縮癥狀的樣品（編號為FJ-13，圖1）提取液與通用抗體呈陽性反應，樣品OD405nm與陰性對照OD405nm的比值＞3，表明該樣品上可能含有病毒。

2.2 電鏡觀察

將ELISA檢測為陽性的西番蓮樣品（FJ-13）提取液進行電鏡觀察，結果見圖2。由圖2可以看出，該樣品中含有大小約750 nm×12 nm的彎曲線狀病毒粒體，與已報道的典型病毒粒體的形態相似。

圖1 西番蓮樣品（FJ-13）花葉、皺縮癥狀

圖2 西番蓮樣品（FJ-13）病毒粒體的電鏡觀察

2.3 通用簡并引物RT-PCR檢測

利用通用簡并引物對西番蓮樣品FJ-13進行RT-PCR。結果表明，LegpotyF/LegpotyR 能從該樣品上擴增到預期大小的目的片段，而從陰性對照和空白對照中未擴增出相應的目的片段（圖3）。將PCR目的片段進行克隆測序，共獲得680 nts的序列，與預期大小相符，包含核內含體蛋白b（nuclear inclusion body ‘b’ protein，NIb）基因3′末端和CP基因5′末端部分序列。BLAST比對結果顯示，該序列與GenBank已報道的夜來香花葉病毒（TeMV）基因序列存在高度一致性，其中與中國廣西分離物（KJ789129）序列一致性最高，達98.2%，與越南分離物（DQ851493）序列一致性最低（79.9%）。RT-PCR檢測結果表明，樣品FJ-13上可能攜帶有的TeMV。

2.4 特異性引物RT-PCR檢測

利用設計的TeMV特異性外殼蛋白引物TeMV- CPf/TeMV-CPr對西番蓮樣品FJ-13進行RT-PCR，結果從該樣品上獲得了大小約816 bp的目的片段（圖4），與預期大小一致。序列測定結果表明，目的片段大小完全相符，序列長度為816 nts（GenBank登錄號為MG189584），為完整的CP基因序列，編碼272個氨基酸。該分離物（命名為BXGFJ-13）的核苷酸序列和氨基酸序列與中國廣西分離物（KJ789129）的一致性最高，分別為98.4%和97.8%；與越南分離物（DQ851493）的一致性最低，分別為86.2%和88.2%；與其他TeMV分離物核苷酸序列一致性在87.9%—92.1%，氨基酸序列一致性在87.9%—93.0%（表1）。此外，在BXGFJ-13 CP基因的氨基酸序列中，第8—10個氨基酸組成與病毒蚜傳相關的保守基序DAG（圖5）。

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：樣品FJ13 Sample FJ13；2：陰性對照Negative control；3：空白對照Blank control。圖4同The same as Fig. 4

圖4 樣品FJ-13的特異性引物RT-PCR

2.5 BXGFJ-13分離物與其他分離物的系統發育分析

根據TeMV的CP基因序列構建系統發育樹，結果表明，來自不同國家、地區的13個TeMV分離物共形成3個類群（圖6）。所有的印度尼西亞分離物以較高的后驗概率聚為第1大類群（Group I），本研究獲得的BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）、兩個泰國分離物Pangda15（AM409188）和Pangda12（AM409187）組成第2大類群（Group II），其中BXGFJ-13分離物與中國廣西分離物（KJ789129）以較高的后驗概率（PP=100%）先聚為一個分支，而后與泰國分離物（AM409188、AM409187）進一步相聚成簇；越南分離物Hanoi（DQ851493）獨立一個分支，單獨形成第3大類群（Group III）。相同地區或寄主來源的分離物優先相聚成簇，表現出很強的地理和寄主特異性。

圖5 BXGFJ-13分離物外殼蛋白基因的氨基酸序列與其他分離物的比對（DAG用黑線框標注）

表1 BXGFJ-13分離物與TeMV其他病毒分離物外殼蛋白基因的核苷酸（nt）和氨基酸（aa）序列一致性

圖6 基于外殼蛋白基因核苷酸序列的系統發育樹

2.6 特異性引物RT-PCR的特異性、靈敏度測定

應用建立的特異性引物RT-PCR方法分別對TeMV、CMV、BtMV、SMV、OrMV、OYDV、EAPV及健康西番蓮樣品進行檢測，結果僅從感染TeMV樣品上擴增出目的片段，從其他病毒及健康西番蓮上均未擴增出目的片段（圖7），表明該方法具有良好的特異性。靈敏度測定結果表明，建立的特異性引物RT-PCR具有較高的靈敏度，當TeMV陽性樣品總RNA原液稀釋102倍時，仍能擴增出清晰的特異性條帶，但進一步稀釋103倍時，擴增出的特異性條帶較淡（圖8）。

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：TeMV樣品TeMV sample；2：CMV樣品CMV sample；3：BtMV樣品BtMV sample；4：SMV樣品SMV sample；5：OrMV樣品OrMV sample；6：OYDV樣品OYDV sample；7：EAPV樣品EAPV sample；8：陰性對照Negative control

3 討論

病毒是西番蓮上發生較為嚴重的一類病毒，對西番蓮的產量能夠造成較大的影響。其中PWV、CABMV和EAPV等病毒侵染西番蓮引起的木質化病，造成的經濟損失巨大[35]。夜來香花葉病毒（TeMV）作為近年來西番蓮上新報道的病毒，目前僅在泰國西番蓮上有明確發生的研究報道[21]，其危害程度、傳播機制、發生規律等尚不清楚，為避免該病毒傳播、擴散和流行后對西番蓮的生產造成重大影響，亟需加強對該病毒的檢測、監測及控制。本研究采用血清學、電鏡觀察、RT-PCR及序列測定的方法對福建果園西番蓮上的疑似帶病樣品的毒源進行了檢測和鑒定，證實一株具有花葉、皺縮癥狀的樣品攜帶有TeMV。為實現對TeMV的準確檢測，設計了一對擴增該病毒CP基因全長的特異性引物，建立了TeMV的特異性分子檢測方法，具有快速、靈敏的優點，同時擴增產物測序結果獲得的CP基因完整編碼區序列可用于后續的病毒種類判定和系統發育分析。

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1：TeMV RNA（100）TeMV RNA (100)；2：101倍稀釋101 times dilution；3：102倍稀釋102 times dilution；4：103倍稀釋103 times dilution；5：104倍稀釋104 times dilution；6：105倍稀釋105 times dilution；7：106倍稀釋106 times dilution；8：陰性對照Negative control

由于西番蓮病毒病的防治十分困難，因此選用無毒的健康種苗是一項有效措施，而病毒快速檢測技術則是篩選無毒種苗的關鍵。近年來，已報道的TeMV鑒定方法主要包括電鏡觀察、血清學檢測和RT-PCR檢測。利用電鏡能夠直接觀察病毒粒體形態，但無法判定具體病毒種類，僅能作為TeMV的輔助鑒定手段。血清學檢測具有操作簡便、結果穩定的優點，但TeMV尚未有商品化的ELISA試劑盒，大多采用通用抗體試劑盒來進行初篩。電鏡觀察、血清學檢測結果只能用于TeMV的初步診斷，該病毒的確認須經RT-PCR和序列分析結果。利用通用簡并引物進行RT-PCR，然后對獲得的序列進行分析，根據序列測定結果判斷病毒種類，該方法已被用于該屬多種病毒的檢測。Zhang等[36]利用通用簡并引物檢測方法，在中國野生茄子上首次鑒定出野生花葉，WTMV）；Ohshima等[37]以采集的日本水仙為材料，應用通用簡并引物檢測方法檢出水仙遲季黃化病毒（，NLSYV）、水仙黃條病毒（，NYSV）、水仙退化病毒（，NDV）和（CyEVA）等多種病毒復合侵染水仙。目前，通用簡并引物用于TeMV檢測的研究報道較少。Noveriza等[38]利用通用簡并引物對印度尼西亞廣藿香進行了TeMV檢測與鑒定。通用簡并引物檢測具有一定的廣譜性，除可以檢測TeMV外，同時還可檢測到西番蓮上可能感染的其他病毒種類，有助于發現復合侵染。但與特異性引物不同，通用簡并引物的RT-PCR產物必須要進一步克隆測序，然后根據測序結果來鑒定病毒種類，并且為防止漏篩，應盡可能測定多個克隆子，相對檢測成本較高。本研究建立的特異性RT-PCR方法，專用于TeMV的檢測，特異性強、靈敏度高，適合于該病毒的針對性檢測。因此，在西番蓮病毒檢測中，可以根據實驗要求的不同，分別選用不同的引物來進行RT-PCR檢測，在僅檢測TeMV時采用特異性引物，若同時檢測是否有多個病毒復合侵染則采用通用簡并引物。

按照國際病毒分類委員會（ICTV）關于病毒的劃分標準，即CP基因氨基酸序列一致性約低于80%；CP基因或整個基因組的核苷酸序列一致性低于76%[39]。本研究測定的BXGFJ-13分離物CP基因氨基酸、核苷酸序列與已報道的TeMV分離物一致性最高分別為97.8%、98.4%，顯著高于80%、76%標準，與病毒種的劃分標準相符，確認BXGFJ-13為TeMV的一個分離物。Chiemsombat等[21]研究報道，西番蓮上的2個TeMV分離物（AM409188、AM409187）的CP基因氨基酸序列中未發現與病毒蚜傳相關的保守基序DAG，DAG被DTG取代，即第9位的氨基酸由A突變為T。本研究從西番蓮上獲得的BXGFJ-13分離物氨基酸序列中存在DAG，說明BXGFJ-13可能通過蚜蟲傳播，但在果園內蟲害調查時未發現蚜蟲，推測這可能受蟲害調查次數限制影響未及時發現蚜蟲，除此之外，也有可能是不通過蚜傳而僅是帶毒苗的扦插或嫁接繁殖引起，BXGFJ-13是否可以蚜傳及其傳播機制有待進一步研究。由于TeMV可能單獨或與其他病毒復合侵染西番蓮，引起嚴重的木質化病，若證實能通過蚜蟲傳播，則極易通過蚜蟲在西番蓮種植區大面積傳播。因此，為防范該病毒暴發流行，應加強西番蓮引種苗的檢測，及時剔除帶毒苗，同時在西番蓮生產期間注意防治蚜蟲。

系統發育分析結果顯示國家（或地區）、寄主來源相同的TeMV分離物優先相聚成簇，表現出很強的地區和寄主特異性，究其原因可能是該病毒的適應性進化同時受地區和寄主所驅動，相似的特征也在的其他病毒中被報道過，比如馬鈴薯Y 病毒（，PVY）和辣椒脈斑駁病毒（，ChiVMV）[40-41]。TeMV分離物與地理（或寄主來源）是否存在關聯可以通過貝葉斯標簽關聯顯著性（Bayesian tip-association significance，BaTS）分析進行驗證。然而，由于本研究中TeMV的樣本量相對有限。因此，后期可能需要更多不同地理或寄主來源的分離物以進一步揭示該病毒的適應性進化特征。

4 結論

采用Indirect-ELISA、電鏡觀察、通用簡并引物RT-PCR、特異性引物RT-PCR及序列測定相結合的方法，從福建西番蓮種植園內檢出夜來香花葉病毒（TeMV）。針對TeMV，建立了特異性強、靈敏度高的分子快速檢測方法，為該病毒的快速檢測提供了可靠的技術支持。

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（責任編輯 岳梅）

Molecular identification and specific detection ofinfecting passion fruit

XIE LiXue, ZHANG XiaoYan, ZHENG Shan, ZHANG LiJie, LI Tao

(FruitResearch Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013)

The objective of this study is to identify(TeMV) on passion fruit in Fujian orchard, develop a molecular method for specific and rapid identification of TeMV, and to provide a reference for prevention and control of the virus.The Fujian passion fruit samples were detected by using the serology method, electron microscopic observation, universal degenerate primers RT-PCR and specific primers RT-PCR. The PCR products of the positive sample were cloned and sequenced. A set of specific primes amplified the total length of coat protein (CP) gene was designed according to the sequences of reported TeMV and sequence determination of this study, and then specific primers RT-PCR detection method was established after optimizing reaction conditions. The sequence determination results were analyzed with BLAST program and DNAMAN software, and the phylogenetic tree was constructed based on the CP gene sequences obtained in this study by using Bayesian inference (BI) method implemented in MrBayes.The serology results showed that one passion fruit sample exhibiting mosaic and crinkle symptom reacted withantiserum. The positive sample was found to have about 750 nm×12 nm linear virions by electron microscopic observation. The expected fragment was amplified from the positive sample by universal degenerate primers RT-PCR, and then cloned and sequenced. Sequence analysis showed that the obtained sequence from the positive sample was identical with the expected size (680 bp), and shared the highest nucleotide sequence identity (98.2%) with the reported TeMV gene sequence. The full-length sequence of CP gene obtained by specific primers RT-PCR was 816 bp (named BXGFJ-13 isolate), and the sequence of nucleotide and amino acid of BXGFJ-13 was 86.2%-98.4% and 88.2%-97.8% identity, respectively, with the reported TeMV isolates. The results of phylogenetic analysis showed that the 13 TeMV isolates could be divided into 3 groups, and the same area or host derived isolates preferentially clustered together, suggesting these isolates had a strong geographical and host specificity. BXGFJ-13 isolate obtained in this paper and Guangxi isolate of China (KJ789129) clustered into a branch with high posterior probability, and then clustered together with two Thailand isolates (AM409188, AM409187) into the 2nd group (Group II), showing that BXGFJ-13 and Guangxi isolate had the closest phylogenetic relationship. The specific primers RT-PCR showed good specificity, which only amplify the expected fragment from TeMV-infected passion fruit sample, and no expected fragment was obtained from(CMV),(BtMV),(SMV),(OrMV),(OYDV),(EAPV) and healthy control. The sensitivity results showed that the target fragment could be amplified from diluted 102fold RNA.According to the species demarcation criteria for thegiven by International Committee on Taxonomy (ICTV) and the results of serological detection and electron microscopic observation, TeMV on the passion fruit sample exhibiting mosaic and crinkle symptom in Fujian orchard was confirmed. The establishedassayof specific RT-PCR could be used for rapid detection of TeMV.

passion fruit;(TeMV); molecular identification; detection

2017-09-26；

2017-10-25

國家質檢公益性行業科研專項（201410076）、福建省現代農業水果產業技術體系崗位項目（閩農科教〔2017〕129）、福建省農業科學院新興特色果類創新團隊（STIT2017-2-4）、福建省農業科學院院管A類項目三農業一融合（A2017-15）

謝麗雪，E-mail：xielx_faas@126.com。

李韜，Tel：0591-87573907；E-mail：leetao06@163.com