布拉氏酵母菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠Treg/Th17免疫平衡的調(diào)節(jié)作用①

陳 沖，顏 玉，王艷鳳

(1.佳木斯大學(xué)研究生部，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科，黑龍江 佳木斯 154003)

布拉氏酵母菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠Treg/Th17免疫平衡的調(diào)節(jié)作用①

陳 沖1，顏 玉2，王艷鳳2

(1.佳木斯大學(xué)研究生部，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化一科，黑龍江 佳木斯 154003)

布拉氏酵母菌；潰瘍性結(jié)腸炎；Treg/Th17平衡

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡，24只清潔級(jí)健康雄鼠，體重均在200～230g，這些大鼠均來自于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-001，分為正常對(duì)照組、模型組、藥物治療組。葡聚糖硫酸鈉DSS(北京賽珂瑪生物科技公司)，布拉氏酵母菌散(億活，深圳市康哲藥業(yè)有限公司)，水合氯醛(北京鼎國生物公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，CD4FITC(英國 Innova Bioscience公司)，CD4PE(Innova Bioscience公司)，大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司)。石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)，石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司)，組織脫水機(jī)(德國Leica公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，PM-4000B圖像分析儀(德國Leica公司)，離心機(jī)(北京離心機(jī)廠LDZ5-2型)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海金達(dá)生化儀器公司)，F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模：在SD大鼠對(duì)環(huán)境適應(yīng)7d之后，從中隨機(jī)抽出8只作為對(duì)照組，并給對(duì)照組服用消毒蒸餾水。剩余的16只服用DSS(用蒸餾水配置的5%葡聚糖硫酸鈉溶液)一周，以此來建立相關(guān)模型，7d后改為飲用消毒蒸餾水及常規(guī)飲食，觀察對(duì)比大鼠的一般狀況、體重及糞便變化。將利用DSS液制備的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型隨機(jī)分為模型組、藥物治療組，每組8只。

1.2.2 給藥：從造模后第4天開始，藥物治療組給予布拉氏酵母菌800mg/kg，溶于1mL生理鹽水中灌腸，1次/天，連續(xù)7d。建立模型的第11天，大鼠24h禁止進(jìn)食，然后稱其體重，并將10%的水合氯醛麻醉注射到大鼠腹腔中，同時(shí)將腹主動(dòng)脈進(jìn)行分離，用肝素抗凝管取出5mL血液。將結(jié)腸分離出，并將病變組織切成腸段，每段長1cm，然后將腸段放到4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，用常規(guī)石蠟進(jìn)行包埋，最后進(jìn)行染色、切片處理，放到顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 血漿TGF-β和IL-6量的檢測：取2mL肝素抗凝的血液300rpm/min，離心15min，取上清，分裝后放入-80℃冰箱保存，解凍后離心再進(jìn)行檢測，檢測時(shí)血漿用樣本稀釋液稀釋10倍，具體步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，根據(jù)樣品光密度(OD)值，查出相應(yīng)濃度，然后乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

HE染色光鏡(100×)觀察，正常對(duì)照組細(xì)胞排列有序，杯狀細(xì)胞沒有明顯的減少，見圖1； 模型組病變集中在黏膜下層和累及黏膜層，可以看出杯狀細(xì)胞明顯減少，腺體多數(shù)損傷，出現(xiàn)很多炎性細(xì)胞，見圖2；藥物治療組黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，腺體排列不整齊，少量纖維素樣滲出，見圖3。

圖1 正常對(duì)照組大鼠腸黏膜(100×)

圖2 潰瘍性結(jié)腸炎模型組大鼠腸黏膜(100×)

圖3 布拉氏酵母菌治療組大鼠腸黏膜(100×)

模型組比正常對(duì)照組大鼠外周血Treg降低(t=2.143，P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠外周血Treg升高(t=1.940，p<0.05)；模型組比正常對(duì)照組大鼠外周血Th17升高(t=2.151，P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠外周血Th17降低(t=1.844,P<0.05)；模型組比正常對(duì)照組大鼠Treg/Th17比值降低(t=2.501,P<0.05)，藥物治療組比模型組大鼠Treg/Th17比值升高(t=1.901,P<0.05)。模型組比正常對(duì)照組大鼠TGF-β1下降(t=2.531,P<0.05)，而IL-6升高(t=2.503,P<0.05)；藥物治療組比模型組大鼠TGF-β1升高(t=1.901,P<0.05)，而IL-6降低(t=1.895,P<0.05)。見表1。

表1 布拉氏酵母菌對(duì)UC大鼠Treg/Th17免疫平衡的影響

3 討論

UC的發(fā)病機(jī)制主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo)引起是目前普遍認(rèn)可的原因，認(rèn)為主要是遺傳與環(huán)境及細(xì)菌協(xié)同作用，而腸道細(xì)菌是引起潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病主要原因[3]。UC的治療藥物有柳氮磺吡啶、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑。安全、有效、副作用小的治療方法是UC的研究熱點(diǎn)。研究表明，益生菌治療UC能夠改善腸道微環(huán)境、延長緩解時(shí)間、降低UC相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生[4]。因此益生菌可能是未來最有希望治療UC的方法之一。

Th17細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-17，在很多免疫性損傷中都有積極的作用，Treg可以采用介導(dǎo)免疫耐受的方式來阻止其本身免疫性疾病的產(chǎn)生[5]。在多種自身免疫性和炎癥性疾病中，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量下降或功能減弱[6]。機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)或自身免疫性疾病時(shí)Th17增加，是破壞體內(nèi)Treg/Th17平衡的原因之一。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是Th17分化所必需的細(xì)胞因子，對(duì)于Treg的分化具有調(diào)節(jié)作用。低濃度TGF-β1與IL-6協(xié)同，誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17分化；高濃度TGF-β1使T細(xì)胞分化為Treg[7]。因此TGF-β1分泌量的變化協(xié)同IL-6影響機(jī)體Treg/Th17平衡，免疫穩(wěn)態(tài)打破時(shí)，IL-17增加，Treg減弱，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致UC的發(fā)生。

[1]劉梓峰,郭珍,李燕舞,等.潰結(jié)靈對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠外周血Treg/Th17平衡的干預(yù)作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2015,(1):1-5

[2]許海英，顏玉，姜威，等.益生菌聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎Claudin-1及TLR4的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2016,39(4)：52-54

[3]顏玉，任秀英，鮑秀琦，等.艾迪莎聯(lián)合益生菌膠囊對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的治療及炎性細(xì)胞因子表達(dá)影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015,38(4)：56-57

[4]方凱，王藝宙，王慧，等.益生菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2013,21(3):270-273

[5]Haruei O,Kazuhiko N,Tsutom I,et al.Regulatory T cells expanded by rapamycin in vitro suppress colitis in an experimental mouse model[J].J Gastroenterol,2012,47(4):366-376

[6]葛婷，唐志鵬，王亮，等.Treg/Th17失衡與炎癥性腸病的關(guān)系[J].世界華人消化雜志，2010,18(7)：689-694

[7]王程玉林,孫軍剛,耿煜,等.Treg/Th17平衡軸在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的意義及流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志，2015,(6):541-544

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：YM2016_020。

陳沖(1989～)女，黑龍江牡丹江人，在讀碩士研究生。

顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:drchenchong@ 163.com。

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