熒光標(biāo)記技術(shù)的研究進(jìn)展分析

張靜

【摘 要】熒光標(biāo)記技術(shù)是把熒光基團(tuán)的共價(jià)鍵連接到蛋白、核酸等能夠識(shí)別分子物質(zhì)上的一種技術(shù)。這種技術(shù)通過(guò)了熒光的信號(hào)物質(zhì)的特定基團(tuán)，與識(shí)別分子物質(zhì)的特定基團(tuán)反應(yīng)，從而完成其標(biāo)記過(guò)程，利用標(biāo)記物的熒光特性，來(lái)提供被檢測(cè)對(duì)象的信號(hào)。熒光標(biāo)記方法具有如無(wú)放射性、操作簡(jiǎn)單、高靈敏度和較好選擇性等優(yōu)點(diǎn)。熒光標(biāo)記物種類(lèi)多、標(biāo)記方法靈活，可應(yīng)用于多種生物大分子以及藥物的檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】熒光標(biāo)記技術(shù)；熒光標(biāo)記物；熒光素

中圖分類(lèi)號(hào)： Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）25-0085-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.25.037

【Abstract】Fluorescent labeling is the process to connect the fluorescent group to the recognition molecules such as proteins and nucleic acids.Based on fluorescent properties of fluorescent-labeled recognition molecules，the targeted molecules can be deteminated.This method has advatanges such as non-radioactive，easy operation，high stability，high sensitivity and high selectivity，and widely applied to detect a variety of biological macromolecules and drugs.

【Key words】Fluorescence labeling technique；Fluorescent marker；Fluorescein

熒光標(biāo)記技術(shù)，也就是利用一些能夠發(fā)熒光的物質(zhì)，再利用共價(jià)鍵結(jié)合在了所要研究的分子的某一個(gè)基團(tuán)之上，然后再利用它的熒光特性，來(lái)提供給被研究的對(duì)象信息的一種技術(shù)。熒光標(biāo)記技術(shù)起源自20世紀(jì)40年代，當(dāng)時(shí)使用熒光標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的一些抗原。隨著分子生物學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及各種先進(jìn)熒光檢測(cè)技術(shù)及儀器的應(yīng)用，熒光標(biāo)記作為一種新的、非放射性的標(biāo)記技術(shù)受到人們很高的重視，并取得了極為迅速的發(fā)展，繼而廣泛應(yīng)用在了細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)檢測(cè)、核酸的檢測(cè)與疾病早期的診斷等，在生物學(xué)研究領(lǐng)域以及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域里發(fā)揮了重要的作用。

1 熒光標(biāo)記技術(shù)的原理

熒光，又叫做“螢光”，是指一種光致的發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某些常溫的物質(zhì)經(jīng)過(guò)某種波長(zhǎng)入射光的照射之后，吸收光能將躍遷到激發(fā)態(tài)，然后通過(guò)振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)化等現(xiàn)象達(dá)到第一激發(fā)態(tài)，隨即在激發(fā)態(tài)停留大約10-8S之后，能夠躍遷至基態(tài)，常常伴有隨光的輻射，這里發(fā)出的光也就是熒光。利用熒光標(biāo)記分子，將其共價(jià)結(jié)合在一些分子識(shí)別物質(zhì)（比如酶、抗原/抗體、DNA、適配體、多肽等）上作為探針，分子識(shí)別物質(zhì)與被檢測(cè)的對(duì)象（比如蛋白、多肽等）進(jìn)行反應(yīng)之后，根據(jù)熒光標(biāo)記分子在反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度變化，對(duì)被檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行各種定量的分析。

2 熒光標(biāo)記物

熒光標(biāo)記試劑也就是提供熒光體的試劑。在熒光標(biāo)記的技術(shù)中，最常用的試劑有羅丹明類(lèi)和熒光素類(lèi)等，其它的熒光標(biāo)記試劑，還有多環(huán)芳烴的化合物、芳香雜環(huán)的化合物類(lèi)以及一些稀土元素的螯合物等，近期發(fā)展起來(lái)的某些新型的熒光標(biāo)記試劑，同樣也受到很大程度的重視。

2.1 熒光素類(lèi)

熒光素類(lèi)的標(biāo)記試劑，包括有標(biāo)準(zhǔn)熒光素及其衍生物。例如熒光素類(lèi)的衍生物，有熒光素異硫氰酸、四氯熒光素、羥基熒光素等。其中FITC是應(yīng)用最為廣泛的一種熒光素的衍生物，它廣泛應(yīng)用于雜交的探針、降解蛋白質(zhì)的測(cè)序以及抗體標(biāo)記中。FAM、TET 等熒光素衍生物，主要在標(biāo)記技術(shù)當(dāng)中，應(yīng)用于核酸探針和DNA的自動(dòng)測(cè)序等。熒光素類(lèi)標(biāo)記試劑的主要結(jié)構(gòu)之中，因?yàn)楸江h(huán)上有比較大的羧基，使得芳香環(huán)保持于和生色團(tuán)垂直的一個(gè)位置，使得熒光量子的產(chǎn)率有所提高。但是熒光素類(lèi)衍生物有也存在一些共同的缺點(diǎn)：比如pH 的敏感性較強(qiáng)、光淬滅率較高、發(fā)射波譜較寬等。

2.2 羅丹明類(lèi)

羅丹明類(lèi)的標(biāo)記試劑，也是標(biāo)準(zhǔn)熒光素的衍生物之一，主要包括有R101、四乙基羅丹明、羧基四甲基羅丹明等。羅丹明類(lèi)試劑的主要結(jié)構(gòu)中R2、R3均為活性基團(tuán)，主要是—NCS、—SO2X 等基團(tuán)。在標(biāo)記反應(yīng)當(dāng)中，活性基團(tuán)大多將與—NH2結(jié)合。與熒光素類(lèi)的衍生物相比而言，羅丹明類(lèi)的熒光素光穩(wěn)定性更強(qiáng)、熒光的產(chǎn)量更高，而且pH 敏感性更低。

2.3 其它熒光標(biāo)記試劑

還有一些熒光標(biāo)記試劑包括：多環(huán)芳烴吲哚、萘、蒽、芘等，芳香雜環(huán)化合物吖啶、香豆素、菲錠類(lèi)等，鑭系稀土的螯合物，藻紅素N、哌洛寧、色霉素A3等。其中吲哚、哌洛寧、色霉素A3主要就是用來(lái)標(biāo)記生物核酸。

2.4 新型熒光試劑

以上傳統(tǒng)的熒光試劑一直以來(lái)應(yīng)用很廣，但也存在著或多或少的缺陷，比如光漂白現(xiàn)象（可能導(dǎo)致了熒光的信號(hào)不穩(wěn)定）。另外，傳統(tǒng)生物分子的熒光標(biāo)記法，只能連接少數(shù)幾個(gè)熒光分子于生物分子的活性基團(tuán)之上，分析的靈敏度很有限。近年來(lái)，納米級(jí)熒光探針的問(wèn)世，為生物標(biāo)記打開(kāi)了新的發(fā)展領(lǐng)域。納米熒光具有（1）激發(fā)的光譜寬，（2）連續(xù)的分布，（3）發(fā)射光譜分布對(duì)稱(chēng)而且寬度窄，（4）顏色可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)。

3 熒光標(biāo)記分析方法

熒光標(biāo)記分析法，即一種生物的分析方法，它以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物。根據(jù)所使用的一些分子的識(shí)別物質(zhì)（比如酶、抗原/抗體、DNA、適配體、多肽等）的不同，可以分為熒光免疫的分析法、基于DNA雜交的熒光分析方法、基于適配體的熒光分析法、基于多肽的熒光分析法等。

3.1 熒光免疫分析法

用熒光的生成試劑，或者是具有強(qiáng)熒光的試劑來(lái)作為標(biāo)記物，進(jìn)行免疫分析，稱(chēng)之為熒光免疫的分析法。熒光免疫分析法有他獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：靈敏度較高，線(xiàn)性范圍也較寬，便于均相的測(cè)定等。但是，由于有機(jī)的熒光標(biāo)記物的激發(fā)光譜以及發(fā)射光的譜斯托克位移比較小，在檢測(cè)發(fā)射光之時(shí)均會(huì)受到激發(fā)光的一些干擾。另外，還有很多有機(jī)的熒光化合物的激發(fā)波長(zhǎng)也較短，使得一些共存物、體液之類(lèi)產(chǎn)生了較強(qiáng)的自發(fā)背景的熒光。這些原因都將導(dǎo)致了熒光免疫的分析法，背景普遍較高，從而限制了它靈敏度的提高。

3.2 基于DNA雜交的熒光分析法

基于DNA雜交的熒光分析法，是DNA 檢測(cè)技術(shù)之中，最常用的一種檢測(cè)方法。在DNA的靶序列上先標(biāo)記上熒光的染料，然后將它與DNA探針進(jìn)行雜交，通過(guò)熒光掃描儀或激光掃描共焦顯微鏡就可獲取熒光的雜交信號(hào)。這種方法成熟穩(wěn)定，但是實(shí)驗(yàn)使用的掃描儀器比較昂貴，所以成本較高，并且熒光在空氣中很容易被猝滅。Bier等[1]用花青的二聚體YOYO以及Picogreen，作為與DNA雙鏈緊密結(jié)合的一種熒光“嵌入劑”，由于和DNA雜交體之間的這種“雙嵌”入作用，使得配對(duì)完全、可以錯(cuò)配單堿基、兩個(gè)以上不匹配而產(chǎn)生的熒光信號(hào)有著明顯的不同，從而能夠明顯的區(qū)分出不同的DNA序列，對(duì)于目的基因的檢出限，達(dá)到了300pg/mL，循環(huán)再生經(jīng)過(guò)60次以后，仍能保持很好的靈敏度。

3.3 基于適配體的熒光分析法

適配體是指，經(jīng)過(guò)體外的指數(shù)富集，從而篩選出來(lái)的一類(lèi)具有著高度的親合力、高度的特異性可以結(jié)合其他分子的一些DNA或RNA的分子。適配體的熒光探針，是把熒光分子標(biāo)記在了適配體之上，從而構(gòu)成的一種新型的探針。報(bào)道的適配體的熒光探針，主要包括有——單熒光修飾型和雙熒光修飾型[2]。單熒光修飾型的適配體熒光探針，是將單個(gè)的熒光基團(tuán)，適當(dāng)進(jìn)行共價(jià)修飾后，將適配體直接當(dāng)做了示蹤的分子，然后以熒光的強(qiáng)度、熒光的壽命、熒光的各向異性值等為衡量指標(biāo)，對(duì)目標(biāo)的靶分子進(jìn)行直接或者間接的檢測(cè)，也可對(duì)適配體與靶分子間的作用方式進(jìn)行闡述，進(jìn)一步提高對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)的靈敏度，降低了檢測(cè)限。

3.4 基于多肽的熒光分析法

通過(guò)隨機(jī)的噬菌體而獲得的多肽，其性能在很多方面都優(yōu)于抗體。多肽常常具有某種特性（例如識(shí)別結(jié)合）是與它的基因序列有著一系列關(guān)聯(lián)的。噬菌體也就是感染細(xì)菌的病毒，作為外源的DNA鏈的表述載體，能將被感染的宿主表達(dá)為一種多肽。噬菌體的外源基因，可以進(jìn)入一個(gè)噬菌體外殼的蛋白基因中，所需要的氨基酸序列，將與內(nèi)源基因相融合，從而產(chǎn)生一個(gè)新的雜交融合性蛋白。當(dāng)細(xì)胞將它們釋放時(shí)，這個(gè)雜交的蛋白外殼，就會(huì)插入到噬菌體的微粒之中，多肽就被表現(xiàn)在了病毒粒子之上。

基于多肽的熒光分析法，是一種基于多肽作為分子識(shí)別的物質(zhì)的一種熒光分析方法，可以分為熒光分析增強(qiáng)法、熒光分析猝滅法。多肽熒光探針在如今細(xì)胞成像的分析當(dāng)中，已經(jīng)成功應(yīng)用。一個(gè)理想的多肽探針，對(duì)于目標(biāo)物將具有很高的親合性以及專(zhuān)一性?，F(xiàn)如今，與不同疾病相關(guān)的靶向的受體以及特定的多肽已經(jīng)合成。這些目標(biāo)多肽將在精準(zhǔn)的熒光標(biāo)記的技術(shù)幫助之下，形成多肽的熒光探針，繼而通過(guò)與受體的蛋白結(jié)合，或者被受體的蛋白作用從而發(fā)出熒光，達(dá)到檢測(cè)所研究目標(biāo)蛋白的目的。多肽的熒光探針都是以發(fā)生了熒光而作為檢測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)，所以可以用于靶向目標(biāo)蛋白的分子成像，成為現(xiàn)代臨床疾病的診斷中不可或缺的技術(shù)，提供了疾病信息較為精確以及專(zhuān)一的診斷。

【參考文獻(xiàn)】

[1]I.Timtcheva，V.Maximora，T.Deligeorgier，et al.New asymmetricmonom ethine cyanine dyes for nucleic-acid labeling：absorption and fluorescence spectral characteristics[J].J Photochem photobiol A：Chemistry， 2000，130：7-11.

[2]T.Maruyama，T.Takata.Simple detection of point mulations in NDA oligonucleotides using SYBR Green[J].Biotechnol Lett，2003，25（19）：1637-164.