基因沉默Smad3對四氯化碳致急性肝損傷的保護作用

王東輝 方 琳 朱 妍 陳 維 (長春醫學高等專科學校基礎醫學部，吉林 長春 3003)

基因沉默Smad3對四氯化碳致急性肝損傷的保護作用

王東輝 方 琳 朱 妍 陳 維1(長春醫學高等專科學校基礎醫學部，吉林 長春 130031)

目的探討基因沉默小鼠Smad3對四氯化碳(CCl4)誘導急性肝損傷的保護作用及可能機制。方法將36只小鼠隨機平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，向Ⅱ、Ⅳ組小鼠尾靜脈注射Smad3 shRNA以抑制Smad3基因表達，Ⅰ、Ⅲ組注射空載體作為對照；向Ⅲ、Ⅳ組小鼠腹腔內注射CCl4橄欖油溶液誘導小鼠產生肝臟損傷，構建小鼠肝損傷模型，Ⅰ、Ⅱ組小鼠僅注射橄欖油作為對照；實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測小鼠肝臟組織Smad3 mRNA的表達水平；采用賴氏法檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)水平；取小鼠肝臟組織切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察其病理改變。結果Ⅳ組小鼠肝組織Smad3 mRNA表達水平明顯低于Ⅲ組(P<0.01)；血清ALT、AST水平明顯低于Ⅲ組(P<0.01)；顯微鏡下觀察可見Ⅳ組小鼠肝組織細胞變性、壞死數明顯少于Ⅲ組，肝組織損傷程度明顯較輕。結論基因沉默Smad3可減輕CCl4對小鼠的肝臟損傷作用，其機制可能為Smad3 基因沉默使小鼠體內自身產生Smad3蛋白減少，削弱了Smad3蛋白對激活素信號途徑的調節作用，減輕激活素(ACT)A介導的肝損傷程度。

Smad3；基因沉默；急性肝損傷

老年患者的肝病15%～20%是由藥物引起〔1〕。激活素(ACT)屬于轉化生長因子(TGF)-β家族成員，能促進細胞生長分化〔2〕。其中ACTA生理作用最為廣泛，可通過介導細胞增殖分化、炎癥反應、免疫應答等方面在疾病的發生及發展中發揮重要作用，但其發病機制仍不明確〔3，4〕。ACT可與ACT Ⅰ型受體(ActRⅠ)、ActRⅡ形成復合物并磷酸化，磷酸化后的ActRⅠ將信號傳給下游的受體型Smad2、3，磷酸化的Smad2、3再與通用型Smad4形成復合物進入細胞核，進而通過調節基因的轉錄影響細胞內的信號傳導功能〔5〕。本研究通過RNA干擾技術沉默小鼠Smad3基因，觀察其對四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器 雄性C57BL/6近交系小鼠(清潔級，合格證號SCXK(京)2009-0004)36只，體重(20±2)g(北京華阜康動物實驗有限公司)。CCl4(北京化工廠)；食用橄欖油購自北京可麗佩翠橄欖油開發中心；Trizol 試劑(Invitrogen公司)；SYBR qPCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)；核酸及蛋白分子量標準品(Bio-Rad公司)。CCl4溶液配制：向9.5 ml橄欖油中加入CCl4試劑0.5 ml，配制成5% CCl4溶液。7300型定時定量PCR儀(美國ABI公司)；Epoch超微量微孔板分光光度計(Biotech，美國)；CX41型生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2動物分組和模型建立 將36只實驗小鼠適應性喂養7 d，隨機平均分為Ⅰ組(橄欖油+空載體組)、Ⅱ組(橄欖油+ Smad3基因沉默組)、Ⅲ組(CCl4+空載體組)、Ⅳ組(CCl4+ Smad3基因沉默組)。Ⅰ組：向小鼠尾靜脈注射空載質粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄欖油試劑(10 ml/kg體重)。Ⅱ組：小鼠尾靜脈注射Smad3基因沉默質粒(3 μg/只)，12 h后腹腔注射橄欖油(10 ml/kg體重)。Ⅲ組：向小鼠尾靜脈注射空載質粒pGCsi-U6/Neo(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄欖油溶液(10 ml/kg體重)。Ⅳ組：向小鼠尾靜脈注射Smad3基因沉默質粒(3 μg/只)，12 h后向腹腔注射5% CCl4橄欖油溶液(10 ml/kg體重)。各組小鼠處理后第3天用生理鹽水進行心臟灌流，處死并收集血清、肝臟組織。

1.3血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸轉氨酶(AST)測定 于小鼠眼部取外周血，收集于抗凝管中，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心10 min得上層血清。制備好血清樣品后按照試劑盒說明書進行操作，分別檢測血清中ALT及AST水平，于490 nm波長處測定吸光度值并繪制標準曲線，根據曲線方程求得樣品值。

1.4小鼠肝組織Smad3 mRNA水平定量檢測 采用Trizol法提取小鼠肝臟組織總RNA，檢測RNA含量及純度，RNA質檢合格后取1 μg進行逆轉錄(總體系為20 μl)，將產物稀釋10倍，取2 μl進行SYBR Green I實時熒光定量PCR(RT-PCR)。反應條件：95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環。PCR 產物的特異性通過溶解曲線檢測，以 GAPDH值為內參照計算 Smad3 mRNA 的相對量。采用 2-ΔΔCt值表示目的基因的相對表達水平，其中，ΔCt =(Ct目的基因-Ct內參基因)，ΔΔCt =(ΔCt 實驗組-ΔCt 對照組)。

1.5小鼠肝組織病理學觀察 取小鼠肝右葉新鮮組織標本，使用濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，24 h后行常規石蠟包埋、切片(厚度3～4 μm)，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6統計學分析 使用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1基因沉默Smad3動物模型的建立 Ⅳ組小鼠Smad3 mRNA表達水平(0.734±0.075)顯著低于其余各組(Ⅰ組：1.328±0.027，Ⅱ組：1.071±0.309，Ⅲ組：2.018±0.017)。

2.2基因沉默Smad3對小鼠血清ALT、AST水平的影響 Ⅳ組小鼠血清ALT及AST水平〔(1 056.36±105.37)、(669.87±39.74)U/L〕均明顯低于Ⅲ組〔(2 767.14±217.28)、(1 373.07±179.34)U/L，P<0.01〕。Ⅰ組分別為(19.65±0.36)、(28.84±0.78)U/L，Ⅱ組為(19.02±0.47)、(21.68±0.43)U/L。

2.3小鼠肝組織的病理改變 Ⅰ、Ⅱ組小鼠肝臟組織細胞呈索狀排列且呈多邊形，有1～2個圓形細胞核，核仁明顯，核膜清楚，核內染色質稀疏，呈正常肝細胞狀態。而Ⅲ、Ⅳ組肝細胞部分表現為核固縮、溶解或消失，出現變性、壞死，其中與Ⅲ組小鼠相比，Ⅳ組小鼠肝損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟病理改變(HE，×200)

3 討 論

各種因素導致的肝損傷在肝病的發生發展中起重要作用。以往的研究表明TGF-β參與肝臟疾病的發生和發展，TGF-β是一簇具有多種功能的蛋白多肽，目前至少發現有 5 種異構體，分別為 TGF-β1～5，均對細胞的生長、分化與免疫反應有廣泛的影響〔6〕。TGF-β1超家族成員ACT是一種與肝損傷有關的致炎因子。ACT有5種亞基，可分別形成ACT A、ACT B、ACT C等 9 種激素〔2〕，ACT A在刀豆蛋白(Con)A誘導的免疫性肝損傷過程中發揮重要的致病作用〔7〕。

ACT信號傳導分為細胞外傳導、受體傳導和受體后傳導，Smads是ACT受體下游的信號分子，通過Smads蛋白調控屬于受體后調節〔5〕，Smad蛋白有8種型，受體調節型 Smad(R-Smads)包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和 Smad8，通用型Smad(Co-Smads)只有Smad4，抑制型Smad(I-Smads)有Smad6和Smad7〔8〕。ACT依次與ActRⅡ、ActRⅠ結合，并使其磷酸化，進而激活下游的Smad2/3，從而進行細胞內信號的傳導〔9〕。有研究者采用 RNA 干擾技術，將針對 Smad3的siRNA 轉染入肝星狀細胞(HSCs)，結果抑制了 HSCs 的增殖，而且還可上調P53、下調Bcl-2表達，從而促進 HSCs 凋亡，最終達到抑制肝纖維化發展的目的〔10〕。CCl4誘導肝損傷模型是目前急性肝損傷的經典模型，損傷作用主要是由于炎癥因子的過量釋放和炎性細胞的大量聚集而產生。另外，作為調控炎癥反應的重要因子，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ也在急性肝損傷的發生發展過程中起重要作用〔11〕。

本研究結果提示ACT信號傳導途徑ACT A-ActRⅡA-Smad途徑的阻斷削弱了CCl4誘導的小鼠肝損傷，基因沉默Smad3對CCl4誘導的肝損傷有一定的保護作用。

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8冉龍嬌，梁 健，鄧 鑫，等.MicroRNA調控TGF-β/SMAD通路調節肝纖維化機制〔J〕.世界華人消化雜志，2017;25(2)：166-71.

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R575

A

1005-9202(2017)24-6023-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.008

吉林省科技發展項目(20060928-01)

1 吉林大學中日聯誼醫院神經內科

陳 維(1964-)，男，主任醫師，主要從事腦血管疾病臨床研究。

王東輝(1968-)，女，博士，教授，主要從事基因治療及細胞信號傳導研究。

〔2017-03-20修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)