枸杞多糖對癲癇大鼠神經的保護作用及機制

馮 云 劉 津 唐海丹 黃曉華 陳海燕 蘇 麗

(右江民族醫學院附屬醫院神經內科，廣西 百色 533000)

枸杞多糖對癲癇大鼠神經的保護作用及機制

馮 云 劉 津 唐海丹 黃曉華 陳海燕 蘇 麗

(右江民族醫學院附屬醫院神經內科，廣西 百色 533000)

目的探討枸杞多糖(LBP)對癲癇大鼠神經細胞的保護作用。方法選擇健康5周齡雄性SD大鼠75只，隨機分為對照組、癲癇組和LBP干預組各25只，LBP干預組灌服50 mg/kg LBP，癲癇組和LBP干預組大鼠癲癇模型制備采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品法，對照組給予等劑量生理鹽水。大鼠海馬組織由溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標記，并進行免疫熒光染色，對比各組BrdU陽性細胞數量、抗兔微管相關蛋白(MAP)-2及抗小鼠神經元核抗原(NeuN)陽性神經元細胞周長及分化率。結果與對照組相比，癲癇組BrdU陽性細胞數量顯著增加(P<0.05)；LBP干預組BrdU陽性細胞數低于癲癇組(P<0.05)；癲癇組大鼠MAP-2、NeuN陽性神經元周長及分化率低于對照組(P<0.05)，LBP干預組大鼠MAP-2、NeuN陽性神經元周長及分化率顯著高于癲癇組(P<0.05)。結論LBP對癲癇模型大鼠進行干預后，大鼠海馬齒狀回顆粒層BrdU陽性細胞數、MAP-2和NeuN陽性神經元細胞表達均出現一定程度改善，具有較好的神經保護作用。

癲癇；枸杞多糖；NeuN陽性神經元

有研究〔1〕報道在生長發育階段若存在癲癇長期反復發作或是癲癇持續狀態，可導致個體存在語言、記憶甚至學習等認知功能障礙。病理生理學研究證實〔2〕，在癲癇發作情況下，能夠導致海馬神經出現異常。枸杞是一種中醫滋補藥材，富含多種營養成分、微量元素，其中重要的一種有效成分是枸杞多糖(LBP)。LBP能夠發揮降血脂、降血糖、抗氧化及抗腫瘤等作用，還能有效保護神經系統，并對損傷的神經起到一定修復作用〔3〕。本研究旨在探討LBP對癲癇大鼠神經細胞的作用，分析LBP對海馬神經元相關保護機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選擇健康清潔級雄性SD大鼠75只，體重(200.1±15.5)g(寧夏醫科大學動物中心提供)。大鼠飼養每籠放置2只，室內溫度控制在(20.5±1.2)℃，相對濕度控制在(50.3±5.1)%，飲食飲水均進行標準化供給，所有SD實驗大鼠均先適應性喂養1 w。將實驗大鼠進行隨機均衡分組，分為對照組、癲癇組及LBP干預組，各25只。

1.1.2主要設備和試劑 HM650V振動切片機(Microm公司提供)；激光熒光顯微鏡(Olympus公司提供)；培養板、培養箱等。主要試劑包括氯化鋰、溴化甲基阿托品、阿托品、地西泮、苯巴比妥(天津市化學試劑研究所提供)；匹羅卡品、溴脫氧尿嘧啶(BrdU)，Sigma公司提供；小鼠抗大鼠BrdU (Immunologicals Direect公司提供)；抗兔微管相關蛋白(MAP)-2多克隆抗體(購自Chemicon公司)；抗小鼠神經元核抗原(NeuN)單克隆抗體(購自Millipore公司)；DMEM/F12(1∶1)無血清培養液；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2 )。

1.2方法

1.2.1癲癇模型 制備癲癇模型采用經典的氯化鋰-匹羅卡品注射法〔4〕：腹腔注射濃度為127 mg/kg的氯化鋰，12 h后進行10 mg/kg溴化甲基阿托品腹腔注射，注射完成后30 min進行(100 ±5)mg/kg劑量的匹羅卡品腹腔注射。若大鼠癇性持續發作時間超過1 h，或大鼠出現嚴重抽搐至瀕危狀態，則需要腹腔注射4 mg/kg地西泮、1 mg/kg阿托品 或25 mg/kg苯巴比妥，直至癇性解除。經典癲癇發作標準〔4〕分為6級：0級：實驗大鼠無任何異常反應；Ⅰ級：大鼠出現面部節律性抽動；Ⅱ級：大鼠出現甩尾或是點頭動作；Ⅲ級：大鼠某一肢體出現抽動動作；Ⅳ級：大鼠軀體僵直或是四肢抽動；V級：大鼠完全僵直，并出現陣攣。大鼠癲癇發作在Ⅳ級以上，且發作解除后狀態良好，可判斷為合格癲癇大鼠模型。對照組則采用等量生理鹽水替代氯化鋰-匹羅卡品，其他處理方式與癲癇組相同。癲癇組、LBP干預組實驗均選擇等級在Ⅳ級以上的大鼠。LBP干預組采用LBP(寧夏啟元藥業有限公司，批號：040603)50 mg/kg灌服，并在造模后持續灌服2 w。

1.2.2BrdU標記處理 所有大鼠在進行末次相關操作后24 h進行BrdU腹腔注射〔5〕，劑量為100 mg/kg，注射后24 h采用4%多聚甲醛PB液150 ml對大鼠進行灌注，直至大鼠全身呈僵硬狀。把大鼠處死后，取腦，放入相同固定液固定24 h，再把大腦置于PB液(含10%～20%蔗糖)中，4℃環境中過夜，直至沉底。取出樣本后置于冠狀位，切取1～2 mm3大腦中海馬組織，并由濃度為0.01 mol/L的PBS配制成5%瓊脂，并用其固定海馬組織切片，厚度50 μm，每只連續取片10張。

1.2.3免疫熒光染色 將各組大鼠海馬組織切片進行PBS漂洗，每次10 min，并漂洗3次，采用2N-HCl在37℃環境中進行抗原修復，持續30 min，后用0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH8.5)沖洗10 min，PBS漂洗2次，分別持續10 min，大鼠BrdU以1∶500比例加入0.01 mol/L胎牛血清(BSA)-PBS，置于4℃冰箱內過夜，再進行3次PBS漂洗，每次10 min。將0.01 mol/L BSA-PBS內加入比例為1∶200標記了Cy3的猴抗大鼠IgG，常溫下再孵育1 h，隨后采用PBS漂洗干凈后，甘油封片。 MAP-2/NeuN免疫熒光染色：常規漂洗、固定、清洗后加入含10%山羊血清的抗體稀釋液(pH7.4)，4℃環境下行2 h封閉，封閉液清洗后，加入200 μl 1∶1 000稀釋的MAP-2多克隆抗體、200 μl 1∶500 NeuN單克隆抗體，室溫下輕搖1 h，隨后置于4℃冰箱中12 h。設定激光共聚焦顯微鏡波長，從X、Y、Z軸三個方向進行觀察。

1.2.4觀察指標 分析海馬神經干細胞向MAP-2陽性神經元、NeuN陽性星形膠質細胞分化等情況，統計增殖細胞的數量，采用Leica Qiwn Plus軟件分析MAP-2/NeuN陽性神經元的周長及分化率。癲癇發作情況下，位于海馬齒狀回內的BrdU陽性細胞出現紅色熒光，計算BrdU陽性細胞數量。

2 結 果

2.1BrdU陽性細胞數 三組大鼠BrdU陽性顆粒細胞數之間的差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組〔(20.23±7.96)個〕相比，癲癇組大鼠、LBP干預組BrdU陽性細胞數〔(32.42±8.43)個，(23.58±6.98)個〕顯著增加(P<0.05)。與癲癇組相比，LBP干預組BrdU陽性細胞數顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2MAP-2陽性神經元周長及分化率 三組大鼠MAP-2陽性神經元周長及分化率的差異具有統計學意義(P<0.05)。LBP干預組、對照組大鼠MAP-2陽性神經元周長及分化率高于癲癇組，且LBP干預組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3NeuN陽性神經元表達情況及分化率 三組大鼠的NeuN陽性神經元周長和NeuN陽性神經元分化率之間的差異有統計學意義(P<0.05)。LBP干預組、對照組大鼠NeuN陽性神經元周長及分化率高于癲癇組，且LBP干預組高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖3。

圖1 BrdU陽性細胞免疫熒光染色(×50)

圖2 MAP-2陽性神經元免疫熒光染色(×50)

組別MAP?2陽性神經元周長(μm)MAP?2陽性神經元分化率(%)對照組93264±88472)486±1432)癲癇組65712±5548322±056LBP干預組105232±321211)2)785±2671)2)F/P值27000/000043566/0000

與對照組比較：1)P<0.05；與癲癇組比較：2)P<0.05；下表同

圖3 NeuN陽性神經元免疫熒光染色(×50)

組別NeuN陽性神經元周長(μm)NeuN陽性神經元分化率(%)對照組64246±119352)471±1342)癲癇組54655±9726346±091LBP干預組74364±158341)2)724±1631)2)F/P值14936/000052673/0000

3 討 論

癲癇易導致患者出現認知障礙，記憶、學習、語言等功能受到損害，其發生發展機制尚未完全確認，治療也缺少金標準〔6〕。研究〔7〕表明，癲癇發作與大腦內海馬存在密切關系，動物模型實驗結果也證實海馬神經在癲癇發生發展過程中起到一定作用，在癲癇發病早期進行海馬神經干預尤為重要。枸杞子作為一種傳統中藥，具有味甘性平等特性，發揮明目養肝、補髓滋腎及祛風等作用。研究表明〔8〕，枸杞中含有主要成分LBP，LBP具有抗氧化、免疫調節、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性作用。尤其近年來對神經保護生物活性研究成為熱點，但對于這種保護作用機制并不是有深入明確的研究，且LBP屬于天然藥物提取物，安全易吸收、價格低廉、易透過血腦屏障，若可以利用LBP的保護神經作用作為治療神經損傷相關疾病的輔助措施，對癲癇等神經功能性疾病的研究具有重要的意義。有研究結果證實〔9〕，LBP能夠對大鼠錳中毒后神經發生數量進行有效干預，從而對小鼠記憶、學習能力起到改善作用，與本文結果一致。

本次實驗結果表明，大鼠癲癇發病后，海馬齒狀回顆粒細胞層的相關神經細胞數目高于對照組，LBP干預組在癲癇模型制作前進行干預，干預完成后齒狀回顆粒層細胞增生水平顯著降低。出現這種現象的原因是癲癇一旦發作，會導致海馬神經異常；LBP具有保護神經細胞的作用，LBP干預后在抑制乳酸脫氫酶釋放的同時，還可以下調caspase-3的活性，降低神經細胞的凋亡率；進行LBP干預后，海馬神經干細胞向 MAP-2/NeuN陽性神經元分化，LBP干預組細胞周長及分化率均顯著高于癲癇組。對實驗結果進行分析，癲癇發病機制主要與大腦內氧自由基過高導致的神經元脫失有關〔10〕。LBP易進入血腦屏障，提高實驗大鼠體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)活性，調節氧化應激狀態，通過P38MAPK途徑有效抑制誘導神經細胞的凋亡，從而可以清除過量的自由基〔11〕；降低脂質過氧化水平，保證神經細胞結構與功能的完整性，促進海馬神經干細胞轉化為 MAP-2/NeuN陽性神經元，修復損傷的神經元等，降低對損傷認知功能的程度，減輕記憶、學習等認知功能障礙情況〔12〕。綜上所述，LBP能夠有效保護大腦內神經細胞，減輕神經元凋亡，對癲癇、阿爾茨海默病等疾病引起的神經元損傷或異常增生起到干預作用；LBP可以通過清除大腦內自由基，降低脂質過氧化，而促進認知功能。本研究的不足之處在于只對大鼠進行了相關研究，并未在其他的動物中重現實驗結果，最重要的是未真正在人體上進行研究，但是依然為臨床上治療癲癇提供了理論依據，為更好地治療癲癇奠定基礎。

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9劉 波，丁協剛，趙頎涵，等.枸杞多糖對大鼠海綿體神經鉗夾損傷的修復作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2013；30(12)：2560-2.

10葛建彬，盧紅建，宋新建，等.枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其抗氧化應激的機制研究〔J〕.中風與神經疾病雜志，2016；33(9)：790-4.

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12董淑楠，朱柯蕙，印 虹，等.枸杞多糖的理化性質及其免疫調節研究進展〔J〕.中國醫藥生物技術，2013；8(1)：66-8.

R749

A

1005-9202(2017)24-6036-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.014

馮 云(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事神經病學研究。

〔2017-01-17修回〕

(編輯 袁左鳴)