七氟烷對人腦膠質瘤細胞侵襲遷移能力的影響及相關機制

謝小娟 樊冬梅 馬立剛 宋紹團 孔金玉 李前輝 郭孝龍

(河南科技大學第一附屬醫院麻醉科，河南 洛陽 471300)

七氟烷對人腦膠質瘤細胞侵襲遷移能力的影響及相關機制

謝小娟 樊冬梅1馬立剛 宋紹團 孔金玉2李前輝 郭孝龍

(河南科技大學第一附屬醫院麻醉科，河南 洛陽 471300)

目的探討七氟烷對人腦膠質瘤細胞侵襲遷移能力的影響及相關機制。方法接種對數生長期的人腦膠質瘤細胞U251于培養皿中，細胞傳代后分為對照組及七氟烷組。對照組通入含5%CO2及95%的空氣，七氟烷組通入5%CO2及92.5%的空氣和2.5%七氟烷，氣流量為2 L/min，處理4 h。Transwell侵襲實驗檢測兩組細胞侵襲能力的變化，細胞劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力，Western印跡檢測兩組細胞上皮間充質轉化(EMT)相關分子〔包括E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、snail及緊密連接蛋白(Zo)-1〕、腫瘤干細胞相關分子(包括CD133)及侵襲相關分子〔包括基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9〕表達的變化。結果七氟烷組穿透基底膜細胞數顯著低于對照組(P<0.05)。七氟烷組細胞24 h后劃痕修復面積差顯著低于對照組(P<0.05)。七氟烷組相比對照組細胞E-cadherin及Zo-1表達顯著上調，N-cadherin、snail、CD133、MMP-2及MMP-9表達顯著下調(P<0.01)。結論七氟烷可顯著抑制人腦膠質瘤細胞的侵襲遷移能力，相關機制可能與其對細胞干性、EMT及MMP的抑制作用有關。

七氟烷；人腦膠質瘤；侵襲及遷移；上皮間充質轉化；腫瘤干細胞

人腦膠質瘤是常見的中樞神經系統原發性腫瘤，發病率約占全部中樞神經系統腫瘤的40%〔1〕。手術切除原發病灶聯合術后放化療是治療腦膠質瘤最有效的方式之一，但由于腦組織功能及結構的限制及腫瘤細胞放化療抵抗的形成，絕大多數患者難以根治進而復發，導致患者5年生存率低于5%〔2〕。七氟烷具有保護腦功能的作用〔3〕，是顱腦手術中常用的吸入性麻醉劑。研究顯示七氟烷可影響多種惡性腫瘤的侵襲遷移能力〔4〕，但其對人腦膠質瘤細胞的影響及相關機制尚不明確。本研究通過體外實驗探究七氟烷與人腦膠質瘤細胞U251侵襲遷移能力的關系及其對侵襲遷移能力相關分子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人腦膠質瘤細胞U251來自美國模式菌種收集中心(ATCC)，由國內北納生物公司提供。

1.2實驗儀器 ECO1.8超凈工作臺、Forma3110生化培養箱(美國Thermo Scientific公司)；DM500顯微鏡(德國Leica公司)；3-16KL高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；電泳儀、轉膜儀及GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；麻醉氣體監測儀(德國Drager公司)，Aestiva7900型麻醉機、七氟烷揮發罐(美國GE Datex-Ohmeda公司)；10、100 μl、1 ml移液器(德國Eppendorf公司)。

1.3實驗耗材 6孔板、Transwell小室、6 cm培養皿(美國Corning公司)，各規格移液槍頭(美國Invitrogen公司)，1.5 ml離心管(德國Sigma公司)，15 ml離心管(中國NEST公司)，聚偏氟乙烯膜(PVDF膜，德國Millipore公司)等。

1.4實驗試劑 七氟烷(批號：161226，日本Maruishi Pharmaceutical公司)，RPMI1640培養基及胎牛血清(BSA，美國Thermo Scientific公司)，30%聚丙烯酰胺(美國Thermo Scientific公司)，四甲基乙二胺、乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶(德國Sigma公司)，無核酶水(美國Invitrogen公司)，十二烷基硫酸鈉及甲醇(國藥集團化學試劑有限公司)，過硫酸銨(中國上海Yeasen公司)，細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒及化學增強發光法(ECL)發光顯色液(中國碧云天公司)等，蛋白酶抑制劑cocktail及蛋白marker(日本Takara公司)。抗體購自美國abcam公司，E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體(ab15148)，N-cadherin抗體(ab18203)，snail抗體(ad180714)，CD133抗體(ab19898)，基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體(ab37150)，MMP-9抗體(ab73734)，β-Actin(M ab8226)，鼠二抗(ab6728)，兔二抗(ab150077)。

1.5實驗方法

1.5.1細胞培養及分組 將3碟同一來源培養于10 cm培養皿中融合度為80%以上的U251細胞使用500 μl胰蛋白酶消化3 min，以1.5 ml/碟含10% BSA的RPMI1640培養基終止消化，其中2碟傳代至另外2碟10 cm培養皿中，得到4碟10 cm培養皿的U251細胞，另外1碟細胞計數，以5×105/孔在2塊6孔板中進行種板。24 h細胞貼壁且6孔板細胞長滿后對4碟細胞進行編號，隨機數字表法將4碟細胞平均分為兩組，對照組細胞在通入含5%CO2及95%空氣的氣體環境下培養4 h，七氟烷組細胞在通入5%CO2及92.5%的空氣和2.5%七氟烷的氣體環境下培養4 h，處理完成后進行后續實驗。

1.5.2Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 用50 mg/L，1∶8的Matrigel膠稀釋液包被Transwell小室底的上室面，4℃風干。風干后吸出殘余液體，50 μl含10 g/L的BSA無血清培養液，生化培養箱中37℃放置30 min水化基底膜。將處理好的兩組細胞胰酶消化并重懸，1 ml含10% BSA的RPMI1640培養基終止消化后轉移至1.5 ml離心管，500 r/min室溫離心5 min，去上清后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，1% BSA無血清培養液重懸并進行細胞計數，取200 μl，5×105/孔細胞加入Transwell上小室，下小室加入600 μl 10% BSA的RPMI1640培養基，置于生化培養箱中37℃，5%CO2培養24 h。10%甲醇固定10 min，0.1%結晶紫染色10 min后，洗凈結晶紫，光鏡下細胞計數，200倍光鏡下觀察膜背面侵襲的細胞數，隨機統計從中間和四周5個視野的總數，重復3次，求其平均值及標準差。

1.5.3細胞劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力 將6孔板中處理好的兩組細胞含10% BSA的RPMI1640培養基棄去，5 ml PBS洗2次，100 μl移液槍頭垂直水平面進行劃痕，每孔3～5條，再次5 ml PBS洗2次后加入無血清RPMI1640培養基培養過夜，于0、12 h進行拍照。ImageJ軟件對細胞12 h前后的劃痕面積占視野的百分比進行計算，取同一視野12 h前后面積的差值(△S)，對照組細胞△S為△S0，七氟烷組為△S1，重復5個視野計算平均值及標準差。

1.5.4Western印跡檢測細胞相關蛋白的表達 收集10 cm培養皿中處理好的兩組細胞，500 μl胰蛋白酶消化3 min，1 ml含10% BSA的RPMI1640培養基終止消化后轉移至1.5 ml離心管中，500 r/min離心5 min，去上清液，PBS洗2次，加入500 μl細胞裂解液及55 μl 10×cocktail，冰上進行裂解2 h后，最大轉速16 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清液于新的1.5 ml離心管中，使用BCA試劑盒進行蛋白定量分析，和上樣緩沖液混合并配平體系，每孔上樣量50 μg。配制10%丙烯酰胺膠，蛋白marker上至兩側上樣孔中，中間孔進行上樣，上樣后80 V穩壓跑出積層膠，調整電壓至120 V穩壓跑1 h，250 mA穩流濕轉至PVDF膜，2 h后取出膜，麗春紅染色，剪取目的條帶后10%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃搖床孵育過夜，孵育濃度為：E-cadherin抗體(1∶1 000)，N-cadherin(1∶1 000)，snail抗體(1∶500)，CD133(1∶500)，MMP-2抗體(1∶1 000)，MMP-9抗體(1∶1 000)，β-Actin(1∶2 000)，12 h后PBS洗膜3次，每次10 min，相應二抗孵育1 h，孵育濃度為1∶2 000，發光液按A、B液1∶1混合后曝光顯影，ImageLab4.2軟件進行灰度掃描，樣品目的蛋白灰度比值為樣品DPI值與內參基因β-Actin DPI值的比值。

1.6統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組細胞侵襲能力比較 七氟烷組細胞24 h后穿透基底膜的細胞數〔(48.1±8.7)個〕顯著低于對照組〔(76.3±11.5)個，t=11.31，P<0.01〕，見圖1。

2.2兩組細胞遷移能力比較 △S1(13.82±4.73)顯著低于△S0(22.96±6.45，t=7.23，P<0.01)，見圖2。

2.3兩組細胞上皮間充質轉化(EMT)相關分子表達比較 七氟烷組相比對照組細胞E-cadherin及Zo-1表達顯著上調，N-cadherin及snail表達顯著下調(P<0.01)；七氟烷組E-cadherin、Zo-1相對灰度值(0.336±0.052，0.406±0.065)顯著高于對照組(0.218±0.067，0.310±0.042;t=8.80，7.85;均P<0.01)。N-cadherin、snail相對灰度值(0.479±0.046,0.381±0.063)顯著低于對照組(0.623±0.064，0.537±0.054;t=11.56，11.89;均P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組細胞穿透基底膜的情況(×200)

圖2 兩組細胞劃痕修復情況

圖3 Western印跡檢測兩組細胞EMT蛋白表達情況

2.4兩組細胞干性相關分子及侵襲相關分子表達比較 七氟烷組相比對照組CD133、MMP-2及MMP-9表達顯著下調(P<0.01)，七氟烷組細胞CD133、MMP-2、MMP-9相對灰度值(0.383±0.061,0.486±0.055,0.160±0.034)顯著低于對照組(0.452±0.072，0.579±0.074，0.241±0.038；t=4.62，6.38，10.04；均P<0.01)。見圖4。

圖4 Western印跡檢測兩組細胞干性相關及侵襲相關蛋白表達情況

3 討 論

七氟烷是臨床上廣泛應用的吸入性麻醉藥，有研究顯示其可選擇性舒張腦血管平滑肌，降低腦血管阻力，增加麻醉過程中腦組織的供氧及灌注〔5〕，同時可降低腦的氧代謝率，起到對腦組織的保護作用〔6〕。Liang等〔7～10〕研究顯示，七氟烷可通過抑制p38/MAPK、缺氧誘導因子(HIF)-1α及MMP家族的表達抑制非小細胞肺癌侵襲轉移能力，且可促進腫瘤細胞放療敏感性增加。徐紅萌等〔11〕發現七氟烷可下調乳腺癌MDA-MB-231細胞MMP-9的表達，進而抑制其侵襲遷移能力。Wei等〔12〕研究發現七氟烷可誘導人非小細胞肺癌細胞A549的凋亡，進而降低細胞活力，增加凋亡小體〔13〕。

Transwell侵襲實驗結果提示七氟烷可減弱人腦膠質瘤細胞的侵襲轉移能力。EMT是與腫瘤細胞侵襲轉移密切相關的生物學過程〔13〕，其代表性分子包括E-cadherin、N-cadherin、snail及Zo-1等。E-cadherin是上皮細胞表達的一種重要的黏附分子，代表細胞的黏附強度，惡變過程中E-cadherin的表達下調往往意味著細胞活動性增加，腫瘤細胞侵襲轉移能力增強〔14〕；N-cadherin及snail是間質細胞標志物，其表達上調意味著細胞EMT程度加深，是腫瘤分化不良的標志；Zo-1是細胞間隙封閉的關鍵因子，其下調可導致細胞間緊密連接中斷，促進癌細胞的擴散〔15〕。本研究結果提示七氟烷可能通過抑制膠質瘤細胞EMT過程，抑制細胞的侵襲和遷移。MMP-2及MMP-9是MMP家族的重要成員，可降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的轉移能力〔16〕；CD133是腫瘤干細胞標志物，其表達上調往往意味著腫瘤細胞惡性程度加深，進而促進腫瘤的惡性行為〔17〕。本研究結果提示七氟烷抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力可能與下調MMP及逆轉膠質瘤細胞干性有關。

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R73

A

1005-9202(2017)24-6054-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.021

1 河南科技大學第一附屬醫院婦產科

2 河南科技大學第一附屬醫院神經外科

郭孝龍(1972-)，男，博士，主任醫師，主要從事神經外科研究。

謝小娟(1976-)，女，碩士，副主任醫師，副教授，主要從事腫瘤患者圍麻醉期應激調控研究。

〔2017-05-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)